miR-217靶向调控HMGA2基因对内质网应激介导的口腔癌细胞自噬与凋亡的影响*

宿伟鹏 赵化荣 李晨曦 刘攀 张洋 龚忠诚

(新疆医科大学第一附属医院1.肿瘤中心;2.颌面肿瘤外科,新疆 乌鲁木齐 830011)

口腔癌是一种总生存率较低的恶性肿瘤,50岁以上人群的发病率较高且近年来趋于年轻化[1]。口腔癌发病机制复杂,治疗选择包括手术、放疗和化疗,但晚期患者进行手术切除可能需要重建部分口腔或面部特征,而放疗和化疗通常会引起一系列严重不良反应[2-3]。微小RNA(miRNA)是包含19-24个核苷酸的单链非编码RNA,可以通过与3′-非翻译区碱基配对,与匹配的靶基因mRNA特异性结合,介导靶基因特异位点的切割或抑制翻译,从而调节基因的表达水平[4]。miRNA在癌症中的生物学作用及其与临床相关性方面的研究取得了显著进展,从而为癌症诊疗开辟了新途径。miR-217在多种癌症中表达下调,如肺癌、结肠癌、胃癌和胰腺癌,并作为肿瘤抑制基因发挥作用[5-8]。但关于miR-217在口腔癌中的表达以及对内质网应激过程的影响尚未明确。本研究通过检测几种口腔癌细胞系中miR-217表达变化,探究其对口腔癌细胞中内质网应激的影响,旨在阐明miR-217调节口腔癌细胞内质网应激的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 人口腔癌细胞系HSC3、SAS、SCC15、FaDu和人正常口腔角质形成细胞系HNOK购于美国ATCC。4-苯丁酸(4-phenylbutyric acid,4-PBA)购于北京康瑞纳生物公司,胎牛血清、青霉素-链霉素双抗、DMEM培养液及牛血清白蛋白购于美国Gibco公司,Lipofectamine 2000转染试剂盒和Trizol试剂盒购于美国Invitrogen公司,miRNA反转录与定量检测试剂盒购于南京诺唯赞生物公司,基因反转录与定量检测试剂盒购于日本Takara公司,Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购于沈阳万类生物公司,Hoechst 33342染液和DAPI染液购于北京索莱宝生物公司,Triton X-100裂解液、RIPA裂解液、BCA蛋白检测试剂盒、ECL发光液以及双荧光素酶报告基因检测试剂盒购于上海碧云天生物研究所,抗体LC3、LC3I、LC3II、Beclin-1、GRP78、CHOP、Caspase-12、GAPDH、异硫氰酸荧光素标记的山羊抗兔IgG及辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG均购于英国Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR) Trizol法提取细胞总RNA,Nano Drop2000超微量分光光度计测定RNA样品纯度、浓度。利用反转录试剂盒,分别合成miRNA与基因对应的cDNA,保存于-20 ℃下备用。以cDNA为模板,通过RT-qPCR实验测定细胞内miRNA和各基因的表达变化,参照试剂盒说明书配制反应体系,在Bio-CFX96定量检测系统上进行扩增,以U6作为miR-217内参基因,以GAPDH作为其余各基因内参基因。扩增结束后,根据扩增曲线得到Ct值,以2-ΔΔCt法计算各基因mRNA相对表达量,实验重复3次。引物序列见表1。

表1 各基因引物序列

1.2.2 细胞分组与转染 在SAS细胞中加入含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素双抗的DMEM培养液,置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养,常规消化传代。待处于对数生长期,将细胞以1×105/孔的密度植入6孔板过夜培养。实验分组及处理如下:①对照组,细胞正常培养。②miR-NC组,将miR-NC转染至细胞。③miR-217 mimic组,将miR-217 mimic转染至细胞。④miR-217 mimic+4-PBA组,将miR-217 mimic转染至细胞,加入含内质网应激抑制剂4-PBA(100 nmol/L)处理24 h。采用Lipofectamine 2000试剂盒按照脂质体法进行转染,严格根据说明书操作,并通过RT-qPCR测定转染效果。处理结束后,收集各组细胞用于后续实验。

1.2.3 流式细胞术 将4组SAS细胞常规消化离心,加入PBS清洗,并加入适量1×binding buffer重悬,调整细胞密度为1×106个/mL,吸取100 μL悬液加入干净的流式检测管中,并依次加入5 μL Annexin V-FITC和10 μLPI,震荡混匀,立即通过流式细胞仪检测各组细胞的凋亡水平。

1.2.4 Hoechst 33342染色 收集4组SAS细胞,经4%多聚甲醛固定后,滴加0.3%Triton X-100透化处理15 min,PBS洗涤细胞,滴加终浓度5 mg/L Hoechst 33342染色,充分覆盖样品,室温避光孵育30 min,吸除染色液,PBS再次洗涤细胞,脱水处理,封片并干燥,在荧光显微镜下观察细胞染色情况,Hoechst33342能透过细胞胞膜,嵌入胞核DNA内,使凋亡细胞发出明亮的蓝色荧光。

1.2.5 细胞免疫荧光染色 用PBS清洗收集的4组SAS细胞,4%多聚甲醛固定,滴加0.3 %Triton X-100透化液处理10 min,采用5%牛血清白蛋白室温封闭30 min。加入兔抗LC3多克隆抗体,以1∶100稀释,4 ℃孵育过夜。吸除一抗,PBS清洗,加入异硫氰酸荧光素标记的山羊抗兔IgG,以1∶200稀释,37 ℃培养箱中避光孵育1 h,吸除二抗,PBS再次清洗。采用DAPI避光复染,室温染色10 min。结束后再次清洗,抗荧光淬灭剂封片,晾干,在激光共聚焦显微镜观察细胞染色情况并拍摄图片,Image J软件分析蛋白表达荧光强度。

1.2.6 Western Blot 在细胞中添加含PMSF的RIPA裂解液提取总蛋白,BCA法定量蛋白。在蛋白样品中加入上样缓冲液,100 ℃水浴中煮沸5 min,使蛋白变性。配置10%聚丙烯酰胺凝胶电泳,取等量变性蛋白上样,恒压电泳分离,电转至PVDF膜。再以5%山羊血清封闭1 h,将印迹与一抗LC3I、LC3II、Beclin-1、GRP78、CHOP、Caspase-12抗体4 ℃共孵育过夜,均以1∶1000稀释。TBST清洗,加入对应二抗辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG,以1∶5000稀释,室温孵育1 h,TBST再次清洗。采用ECL避光显影,Image J软件分析蛋白条带灰度值,内参蛋白为GAPDH,蛋白相对表达量以目的蛋白与内参蛋白的灰度值之比来表示。

1.2.7 双荧光素酶报告基因检测实验 通过Starbase在线工具预测miR-217与HGMA2之间是否存在靶向互补结合位点。根据预测结果,为了进一步确定HGMA2是否是miR-217的直接靶标,设计HGMA2的野生型(HMGA2 3′-UTR WT)及突变型(HMGA2 3′-UTR MUT)序列,并克隆到荧光素酶质粒中。取对数生长期的SAS细胞植入6孔板,按照脂质体法将构建的报告基因质粒分别与miR-NC或miR-217 mimic转染至SAS细胞内,转染48 h后,利用双荧光素酶试剂盒对两组细胞中荧光素酶活性进行检测分析。

2 结果

2.1 口腔癌细胞中miR-217与HMGA2表达检测结果 RT-qPCR检测结果显示,与人正常口腔角质形成细胞系HNOK比较,人口腔癌细胞系HSC3、SAS、SCC15、FaDu中miR-217相对表达量显著下调(P<0.05),而HMGA2相对表达量则显著上调(P<0.05),见图1。

图1 人正常口腔角质形成细胞与口腔癌细胞中miR-217与HMGA2表达比较

2.2 miR-217对口腔癌细胞凋亡的影响 流式细胞术检测结果显示,与对照组比较,miR-217 mimic组SAS细胞凋亡率显著升高(P<0.05),miR-NC组细胞凋亡率则未发生显著变化(P>0.05);与miR-217 mimic组比较,miR-217 mimic+4-PBA组细胞凋亡率显著下降(P<0.05),见图2。Hoechst 33342染色结果显示,对照组和miR-NC组细胞胞核外围轮廓清晰,染色均匀,多数为暗蓝色低荧光,偶见呈亮蓝色高荧光的核浓缩细胞,说明凋亡细胞较少; miR-217 mimic组细胞染色不均匀,有大量呈亮蓝色高荧光,说明凋亡细胞较多;而相较于miR-217 mimic组,miR-217 mimic+4-PBA组细胞染色恢复均匀,亮蓝色高荧光细胞明显减少,说明凋亡细胞减少。见图3。

图2 流式细胞术检测各组SAS细胞凋亡率

图3 Hoechst 33342染色观察各组SAS凋亡情况(100×)

2.3 miR-217对口腔癌细胞自噬的影响 细胞免疫荧光染色结果显示,与对照组比较,miR-217 mimic组SAS细胞中LC3荧光强度显著升高(P<0.05),而miR-NC组与对照组的LC3荧光强度之间差异无统计学意义(P>0.05);与miR-217 mimic组比较,miR-217 mimic+4-PBA组SAS细胞中LC3荧光强度则又显著下降(P<0.05)。见图4。

图4 细胞免疫荧光染色观察各组SAS细胞中LC3表达(200×)

2.4 miR-217对口腔癌细胞内自噬相关蛋白表达的影响 Western Blot检测结果显示,与对照组比较,miR-217 mimic组SAS细胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值与Beclin-1蛋白相对表达量均显著上调(P<0.05),miR-NC组各蛋白表达未发生显著变化(P>0.05);与miR-217 mimic组比较,miR-217 mimic+4-PBA组细胞中LC3-Ⅱ/LC-3Ⅰ比值与Beclin-1蛋白相对表达量均显著下调(P<0.05),见图5。

图5 Western Blot检测各组SAS细胞中自噬相关蛋白表达

2.5 miR-217对口腔癌细胞中内质网应激相关分子表达的影响 RT-qPCR和Western Blot测定结果显示,与对照组比较,miR-217 mimic组SAS细胞中GRP78、CHOP、Caspase-12的mRNA相对表达量与蛋白相对表达量均显著上调(P<0.05), miR-NC组则未发生显著变化(P>0.05);与miR-217 mimic组比较,miR-217 mimic+4-PBA组细胞中GRP78、CHOP及Caspase-12的mRNA相对表达量与蛋白相对表达量均显著下调(P<0.05),见图6。

图6 各组SAS细胞中内质网应激相关分子表达

2.6 miR-217与HMGA2的靶向关系检测与验证 经预测发现HMGA2与miR-217在特定区域存在碱基互补现象,见图7A。双荧光素酶报告基因实验显示,与miR-NC与HMGA2 3′-UTR WT共转染的细胞比较,miR-217 mimic和HMGA2 3′-UTR WT共转染的细胞中荧光素酶活性显著降低(P<0.05),见图7B。此外,Western Blot检测结果显示,与miR-NC组比较,miR-217 mimic组细胞中HMGA2蛋白相对表达量显著下调(P<0.05),见图7C。

图7 miR-217与HMGA2靶向关系

3 讨论

口腔癌的发生发展涉及多种因素,并伴有遗传和表观遗传的不稳定性。随着新一代测序技术的广泛应用,越来越多的研究表明,一些miRNA在口腔癌中存在差异表达,这些差异表达的miRNA可能有助于区分口腔癌患者和健康受试者。此外,一些miRNA的表达谱已证明与临床分期、转移和患者存活率呈正相关,表明这些miRNA可被视为口腔癌的预后指标[9-10]。已知miRNA通过调节其靶基因的表达水平,参与肿瘤细胞的多种生物学过程。因此,调控癌症中miRNA的表达作为一种新型治疗策略受到了越来越多的关注。miR-24-3p、miR-155-5p和miRNA-10a促进口腔癌细胞的增殖[11-13],沉默这些miRNA的表达可能会阻止口腔癌的进展。相反,许多miRNA具有抗癌功能,例如miR-6887-5p与miR-34a-5p能够抑制口腔癌细胞增殖、侵袭和转移[14-15],过表达这些miRNA能够发挥抗癌作用。

本研究经检测人正常口腔角质形成细胞系HNOK与人口腔癌细胞系HSC3、SAS、SCC15、FaDu中miR-217表达水平,结果显示其在口腔癌细胞中的相对表达量显著下调,提示miR-217低表达可能与口腔癌的发生发展相关。Jiang等[5]研究表明miR-217可通过调节靶向调节 sirtuin 1进而调控P53/KAI1轴抑制非小细胞肺癌的细胞增殖、迁移和侵袭,阻止非小细胞肺癌脑转移过程。Chen等[16]研究发现miR-217在 40例胃癌患者的肿瘤组织及肿瘤转移组织中表达下降,并通过靶向PTPN14抑制胃癌细胞的转移、侵袭及上皮间质转化。miR-217在宫颈癌组织及细胞系中表达下降,提高其表达水平能够抑制宫颈癌细胞的迁移和侵袭,并促进细胞凋亡[7]。由此可见,miR-217可能在抑制包括口腔癌在内的多种肿瘤中发挥重要作用。

自噬是一个高度调节的过程,涉及细胞溶质成分、长寿命蛋白质或受损细胞器的更新。作为一种假定的适应性分解代谢过程,自噬在营养剥夺期间被激活,以促进细胞存活。然而,越来越多的证据表明,在某些情况下过度的自噬水平对细胞凋亡至关重要,在细胞发生凋亡的同时,常也伴随着自噬,两者之间存在一定的相互作用关系[17]。本研究在口腔癌细胞转染miR-217 mimic后,经实验检测发现,转染miR-217 mimic的细胞凋亡增加,细胞中自噬标志物LC3蛋白荧光强度增强,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值与Beclin-1蛋白表达水平均升高,由此推断,miR-217能够促进口腔癌细胞的自噬与凋亡。

内质网是一种不可或缺的真核细胞器,控制蛋白质的生物合成和运输,并维持细胞内稳态。许多因素包括蛋白质降解、钙失衡、缺氧和细胞氧化还原调节,都会影响内质网稳态并触发未折叠蛋白反应的保护机制,该机制旨在维持细胞存活并帮助重建稳态。然而,但当内质网承受压力过强或外界刺激持续时间过长时,出发内质网应激信号通路变为细胞凋亡通路,诱导细胞死亡[18]。GRP78是参与内质网应激的标志蛋白,其提示内质网应激的发生,当内质网应激激活时间延长时,通过促进CHOP和Caspase-12的表达引发细胞凋亡[19]。本研究结果显示,转染miR-217 mimic的口腔癌细胞内GRP78、CHOP、Caspase-12的mRNA与蛋白表达水平均升高,而转染miR-217 mimic同时采用内质网应激抑制剂4-PBA处理的口腔癌细胞中不仅GRP78、CHOP、Caspase-12表达下降,LC3蛋白荧光强度、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及Beclin-1蛋白表达也均下降,且细胞凋亡减少,这一结果表明miR-217可能通过触发内质网应激途径促进口腔癌细胞的自噬与凋亡。

为了进一步研究miR-217抑制口腔癌的分子机制,本研究通过生物信息学在线工具进行预测发现HMGA2与miR-217在特定区域存在碱基互补现象。而进一步双荧光素酶报告基因实验和Western Blot验证了两者的靶向关系,揭示了miR-217负调控HGMA2表达。HGMA2在胚胎发育过程中参与细胞增殖和分化,此外,还有多项研究已经证实HMGA2在恶性肿瘤中呈现高表达,这可能在肿瘤的发生与进展中发挥关键作用,并与患者的预后不良密切相关,而下调其表达能抑制肿瘤发生与发展[20-22],因此可作为一个潜在的肿瘤治疗靶点。

4 结论

miR-217可通过激活内质网应激途径,进一步诱导自噬与凋亡通路,从而诱导口腔癌细胞凋亡,且miR-217的该作用可能与其靶向调控HGMA2表达相关。然而,本研究针对口腔癌中miR-217的机制进行了体外实验初探,其详细功能机制仍有待于进一步挖掘。