堆肥用低温菌的筛选与鉴定

张 婷 冯 曼 张莹莹 张 玲 李新畅 李海燕 石爱丽 李 洁

（1承德市农林科学院，河北承德 067000；2河北民族师范学院，河北承德 067000）

我国北方地区秋冬漫长且温度较低，农业废弃物处理难度加大，发酵周期延长，易造成环境污染和资源浪费。研究认为，15 ℃是低温堆肥的临界温度，当环境温度低于15 ℃时，堆肥起温速度降低甚至无法正常起温，使得堆肥难以自发进行，无法有效发酵[1]。现阶段，冷凉地区为解决秋冬季节堆肥启动保温等问题，更多的采用向堆体中灌注热水和蒸汽，或者增加保温材料等方法，不仅费时、费力且效果不明显。低温菌在低温状态下可以利用其特殊的生理机制来降解堆肥物料中的糖类、淀粉、蛋白质等简单的有机物，使肥堆温度迅速上升，带动纤维素降解菌等中温功能菌进入中温期，进而产生大量的生物能使堆肥进入高温期，完成高温阶段无害化处理。

废弃物腐熟过程中，受低温环境及微生物酶活性的影响，单一的菌株因其稳定性、存活率差，很难高效降解废弃物，利用微生物间的协同作用来提高混合菌株的酶活和酶量，对于堆肥效率及品质的提高都有积极作用[2]。何志刚等[3]采用低温连续富集继代培养方法从低温菌源样品中筛选获得一组高效稳定分解玉米秸秆的复合菌群。王一然等[4]在宏基因组测序基础上优化低温玉米秸秆降解菌群，使秸秆降解潜力显著升高。但在农业废弃物发酵中，仅有纤维素降解菌是不够的。秸秆、菌渣、牛粪等农业废弃物中的粗蛋白含量相对较高，筛选具有降解蛋白质功能的菌株，对于堆肥初期快速升温也十分必要。此外，在堆肥前期，有机氮在微生物的代谢活动下会产生大量氨气，而固氮微生物在除臭保氮方面发挥着重要作用，因此筛选低温固氮菌，一方面能够通过低温菌的代谢活动加快堆肥温度上升，另一方面还能够通过固氮作用减少氨气挥发，达到除臭保氮的效果[5]。粪便中的磷元素多以磷酸钙等化合物形式存在，植物难以直接吸收利用，溶磷菌可以通过其代谢活动将难溶性磷分解为可被植物吸收利用的可溶性磷，从而提高磷元素的利用率。添加低温微生物菌剂是低温环境下实现堆肥快速启动的有效方法，对农业废弃物在低温环境下迅速起温发酵具有重要意义。本研究采用平板涂布法从低温菌源样品中筛选固氮、溶磷及分解蛋白质和纤维素的功能菌，以期为堆肥用低温菌群的构建提供菌种基础。

1 材料与方法

1.1 样品采集

于2021年10月采自河北承德围场燕格柏乡自然腐熟的肥堆样品，主要成分为牛粪、秸秆等农业废弃物。

1.2 仪器与设备

ZWYR-D 叠式恒温培养振荡器（上海智诚分析仪器制造有限公司），PHS-2F 型pH 计（上海仪电科学仪器股份有限公司），HWS 系列智能恒温恒湿箱（浙江托普云农科技股份有限公司），752N紫外可见分光光度计（上海仪电科学仪器股份有限公司）。

1.3 培养基

（1）牛肉膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，琼脂15.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0～7.2。

（2）酪蛋白培养基：酪蛋白10.0 g，牛肉膏3.0 g，NaCl 5.0 g，K2HPO42.0 g，琼脂15.0 g，溴百里香酚兰0.05 g，蒸馏水1 000 mL。

（3）羧甲基纤维素钠培养基：羧甲基纤维素钠5.0 g，KH2PO41.0 g，NaNO33.0 g，KCl 0.5 g，MgSO40.5 g，Fe3SO40.01 g，琼脂18.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH自然。

（4）无氮固体培养基：甘露醇10.0 g，KH2PO40.2 g，MgSO40.2 g，NaCl 0.2 g，CaCO35.0 g，CaSO40.1 g，琼脂15.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0。

（5）无机磷固体培养基：葡萄糖10.0 g，(NH4)2SO40.5 g，NaCl 0.3 g，MgSO40.3 g，MnSO40.03 g，KCl 0.3 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，Ca3(PO4)25.0 g，琼脂15.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0～7.5。

（6）有机磷固体培养基：葡萄糖10.0 g，(NH4)2SO40.5 g，NaCl 0.3 g，酵母浸粉0.5 g，KCl 0.3 g，MgSO40.3 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，MnSO40.03 g，卵磷脂0.2 g，CaCO31.0 g，琼脂15 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0～7.5。

1.4 低温菌分离纯化

取样品加入盛有无菌水的锥形瓶中，置于10 ℃低温下充分振荡30 min，将获得的菌悬液按梯度稀释至10-4、10-5、10-6浓度后，涂布至牛肉膏蛋白胨固体培养基上，10 ℃低温培养3～5 d，待有菌落长出后根据菌落不同形态挑取单菌落进行纯化，直至获得纯菌株，并对不同单菌落进行编号。

1.5 低温菌功能复筛

将获得的单菌株分别接种至选择培养基上，于10 ℃下培养3～5 d，观察培养基上菌株生长情况，将能够在选择培养基上生长并有明显透明圈的菌株转接至相应的固体培养基上，继续培养，转接至少3次以上获得功能稳定的菌株。

1.6 生理生化特性测定

根据《常见细菌系统鉴定手册》对筛选出来的低温功能菌进行形态鉴定，并测定菌株的生理生化指标，包括甘露醇、木糖、V-P、明胶液化、淀粉水解等生化指标测定。

1.7 低温功能菌拮抗试验

采用交叉划线法对获得的低温功能菌进行拮抗试验，挑取各菌株单菌落在牛肉膏蛋白胨固体培养基上呈十字形交叉划线，置于10 ℃低温培养箱中培养3～5 d，观察各菌株在交叉划线处是否能够正常连续生长，以验证各菌株之间是否存在拮抗作用以及是否能够联合使用构建低温菌系。

1.8 分子生物学鉴定

将功能复筛获得的低温菌株纯化培养后，提取基因组DNA，并利用细菌通用引物27F:AGAGTTTGATCMTGGCTCAG；1492R:GGTTACC TTGTTACGACTT进行PCR扩增，扩增产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。测序结果在NCBI上进行BLAST序列比对，并构建系统发育树，确定菌株分类地位。

2 结果与分析

2.1 低温菌株的分离与纯化

采用平板涂布法从样品中共筛选出9 株细菌，在10 ℃低温环境下生长良好且表现出不同的菌落形态。对筛选出来的低温菌株进行编号，并挑取单菌落进行多次分离纯化获得纯菌株。

2.2 低温菌功能复筛

利用选择培养基从筛选出的低温菌中复筛具有固氮、解磷、分解酪蛋白以及降解纤维素的功能菌株，共获得4 株低温功能菌。其中，D21 具有固氮和溶解有机磷功能，D25和D29具有溶解有机磷、无机磷和分解酪蛋白的功能，D33 具有分解酪蛋白的功能，未筛选出纤维素降解菌（表1和图1）。

图1 低温菌功能复筛效果

表1 低温菌功能复筛结果

2.3 菌株生理生化特性

4株低温功能菌生理生化指标鉴定结果见表2。4种菌V-P检测均呈阴性，在7%盐浓度及厌氧环境下均不能生长。柠檬酸盐、丙酸盐、D-木糖醇、L-阿拉伯糖、D-甘露醇条件下均能正常生长，pH 5.7 酸性条件下均能正常生长，且接触酶试验均呈阳性。淀粉水解测定结果显示D25和D29菌株可以水解淀粉；只有D21 菌株能够还原硝酸盐；在明胶液化方面，除了D21菌株不能液化明胶外，其他3种菌均能够液化明胶。

表2 4株菌株生理生化特征

2.4 菌株拮抗试验

4 株低温功能菌拮抗试验结果如图2 所示，4 株菌在十字交叉划线处均可以正常连续生长，说明筛选出的4 株低温功能菌之间没有拮抗作用，能够共同生长，可以联合使用构建低温堆肥复合菌剂。

图2 低温功能菌拮抗试验结果

2.5 菌株的分子鉴定

将测序获得的序列进行BLAST 比对，并构建系统进化树，确定4株低温功能菌分类地位，鉴定结果显示，4株低温菌分别为D21Pantoea coffeiphila、D25米氏假单胞菌（Pseudomonas migulae）、D29Pseudomonas canadensis，D33 盖氏假单胞菌（Pseudomonas gessardii）（图3）。

图3 低温菌株系统进化树

3 讨论与结论

好氧堆肥过程主要包括升温阶段、高温阶段和腐熟阶段。起始升温阶段肥堆中的糖类、淀粉和蛋白质等易腐烂的有机物质被微生物分解，产生二氧化碳和氧气并释放能量，使堆肥温度逐渐上升至高温阶段。堆肥易受外界环境温度的影响，北方寒冷地区秋冬季节堆肥起温比较缓慢，微生物代谢活动降低，发酵周期延长，严重降低了堆肥效率和有机肥品质。利用低温功能菌的代谢活动，实现堆肥的快速启动，成为现阶段解决低温发酵问题的有效方法。

本研究从农业废弃物中筛选出低温功能菌4株，具有固氮、溶磷和分解酪蛋白的功能，经鉴定这4种功能菌分别为泛菌（Pantoea coffeiphila）、米氏假单胞菌（Pseudomonas migulae）、Pseudomonas canadensis和盖氏假单胞菌（Pseudomonas gessardii）。泛菌具有固氮功能，在10 ℃低温环境下生长24 h 后OD 值可达1.374。在堆肥过程中氮素极易挥发损失，通过添加固氮微生物可以一定程度上提高堆肥的含氮量。蒲一涛和邢苗[6]发现在堆肥第2次发酵时添加固氮菌能够加快肥堆的降解速率，缩短堆肥发酵时间，提高有机肥的肥效和品质，对提高土壤固氮能力和促进植物生长发育都具有积极作用。石春芝等[7]将自生固氮菌和纤维素分解菌加入堆肥中，发现堆肥中含氮量提高，且纤维素分解菌对固氮菌的生长表现出一定的协同效应。本研究筛选的固氮菌可以为废弃物低温发酵中生物保氮剂的研发应用提供菌种基础。

米氏假单胞菌具有溶解有机磷、无机磷和分解酪蛋白的功能，该菌能在10 ℃低温环境下生长，培养24 h后OD值可达1.945。研究表明，Pseudomonas migulae可作为低成本的生物接种剂，不仅能够促进绿豆植物的生长[8]，还能够促进番茄的生长[9]。Pseudomonas canadensis与米氏假单胞菌相似，具有溶解有机磷、无机磷和分解酪蛋白的功能，但与米氏假单胞菌不同的是，该菌在10 ℃培养24 h 后OD 值仅为0.518，说明其耐低温能力比米氏假单胞菌差，但该菌在生防[10-11]方面表现出一定的优势。

盖氏假单胞菌能够分解酪蛋白，在酪蛋白培养基上产生明显的透明圈。低温环境下发酵，起温阶段需要有低温菌株通过降解蛋白质等简单有机物产生生物能来提高堆体温度，盖氏假单胞菌不仅在低温发酵起温阶段起到重要作用，还能够促进植物的生长。研究发现，盖氏假单胞菌接种于大麦上能够促进植株生长，提高叶绿素、酚类、可溶性糖等物质的含量[12]。

农业废弃物的发酵过程实际上就是微生物发酵过程，微生物通过新陈代谢活动进行有机物分解，一方面可以维持自身的生命活动，另一方面分解产生的小分子物质可以直接被植物吸收利用。在低温环境下，发酵需要低温菌通过代谢活动产生热量快速将堆体温度升至中温及高温阶段，以缩短发酵周期，克服低温下发酵升温缓慢的问题。本研究获得的低温功能菌，可以为低温菌剂的研发提供菌种基础，丰富微生物菌种资源。