3种黄檀属木材DNA条形码识别研究

余敏 张彭俐 王金波 高俊兰

摘要 以降香黄檀、交趾黄檀和微凹黄檀木材为研究对象，提取木材DNA并扩增trnL和trnS-trnG序列，比较黄檀属候选DNA条形码序列的扩增和测序成功率，构建系统发育树并评价不同DNA条形码序列的鉴定能力。结果表明：3种黄檀属木材叶绿体编码基因片段trnL和叶绿体基因间隔区trnS-trnG序列的PCR扩增成功率分别为82%和59%，PCR产物克隆测序成功率均为100%。候选DNA条形码序列种间的碱基变异和插入缺失数量均高于种内。基于叶绿体编码基因序列trnL构建的系统进化树能够成功区分3种黄檀属木材。

关键词 黄檀属；DNA提取；DNA条形码；木材识别

中图分类号 TP391.44  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2023）14-0099-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.14.024

作者简介 余敏（1985—），男，河南信阳人，讲师，从事木材DNA识别研究。*通信作者，副研究员，博士，从事木材生物形成研究。

DNA条形码技术已被证实是一种科学有效的物种识别方法，该方法具有操作简单，不受个体发育阶段和形态特征的限制，鉴定快速准确等诸多优点，极大地弥补了传统分类学方法的不足［ 1-2］。黄檀属木材多具有较高的经济价值，其非法采伐和非法木材贸易情况严重，采用传统的木材识别方法难以准确识别到种［ 3-4］。为此，笔者以市场上3种常见的黄檀属木材为研究对象，通过提取木材标本DNA并扩增叶绿体编码基因片段trnL序列和叶绿体基因间隔区trnS-trnG序列，比较黄檀属候选DNA条形码序列的扩增和测序成功率，并对物种间稳定的变异位点进行分析，采用NJ树法评价2条候选DNA条形码序列的鉴定能力，以期為黄檀属木材候

选DNA条形码筛选和识别提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

所用的试验材料取自安徽农业大学木材标本馆，

共选取22个试验样品。其中，降香黄檀（Dalbergia odorifera T.Chen）木材样品9个，交趾黄檀（Dalbergia cochinchinensis Pierre）木材样品6个，微凹黄檀（Dalbergia retusa Hemsl.）木材样品7个。

1.2 试验方法

1.2.1 木材DNA的提取和纯化。

木材DNA提取和纯化参照已发表文献方法进行操作［ 5］。

1.2.2 DNA条形码序列的扩增。

分别以降香黄檀、交趾黄檀和微凹黄檀木材提取纯化后的DNA为模板，扩增叶绿体编码基因片段trnL序列和叶绿体基因间隔区trnS-trnG序列。DNA条形码PCR扩增引物信息和扩增反应体系见表1。

1.2.3 PCR产物的胶回收纯化。

针对具有非特异性扩增的PCR扩增产物，需对PCR产物进行胶回收纯化处理，PCR产物的纯化操作采用TIANgel Midi Purification Kit进行胶回收纯化。

1.2.4 PCR产物的连接和转化。

PCR产物的连接和转化操作按照全式金pEASY-T3 Cloning Kit操作说明进行。

1.2.5 阳性重组子的鉴定。

阳性克隆检测采用M13通用引物扩增克隆载体插入片段区域鉴定阳性克隆。

1.2.6 DNA条形码序列测序。

将鉴定为阳性克隆重组子的菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序［ 6］，为保证测序结果准确性，每个样品选择5个独立的阳性克隆重组子进行测序。测序所用仪器为ABI PRISM3730xl DNA Analyzer，所测样品均选用双向测序。

1.2.7 DNA条形码序列分析和系统发育树的构建。

采用Lasergene Suite 7软件去除引物两端载体序列，用BioEdit（Version7.01）编辑和校正多重比对结果。采用MEGA 7软件对黄檀属物种间的DNA条形码序列进行多重比对，对种间稳定的变异位点进行分析。采用邻接法（neighborjoining，NJ）将Genbank数据库中已公布的3种黄檀属trnL和trnS-trnG序列（表2）和该研究中PCR产物克隆测序获得的DNA条形码序列构建系统发育树，系统发育树各分支的置信度用自举检验法（bootstrap text）作1 000次可信度分析［ 7-8］。

2 结果与分析

2.1 DNA条形码序列的扩增和测序

由图1可知，叶绿体编码基因片段trnL的PCR扩增效率为82%，叶绿体基因间隔区trnS-trnG的PCR扩增效率为59%。对有效扩增的DNA条形码序列进行PCR产物克隆测序，测序成功率均为100%。PCR扩增和测序结果表明，较短的DNA条形码序列扩增成功率高，片段越长，扩增效率越低，叶绿体基因片段的扩增成功率要高于叶绿体基因间隔片段。

2.2 DNA条形码序列的比对和分析

通过对降香黄檀、交趾黄檀和微凹黄檀木材trnL和trnS-trnG序列进行多重比对，结果表明，3种黄檀属木材的2条候选DNA条形码序列的种间碱基变异和插入缺失数量均高于种内，trnL序列的变异来源主要来自于碱基序列的颠换，主要发生在120～275 bp位点上。trnS-trnG序列的变异来源主要为碱基的插入/缺失，主要发生在68～74 bp和131～135 bp位点上，碱基变异转换数量大于颠换数量（表3、4）。

2.3 3种黄檀属木材系统发育树聚类分析

通过对候选DNA条形码序列trnL和trnS-trnG进行多重比对，所有对位排列结果中的空位或缺失数据作完全删除处理，采用邻接法（neighborjoining，NJ）构建无根系统发育树［ 9-10］。使用trnL序列构建系统发育树（图2），降香黄檀、交趾黄檀和微凹黄檀均能够正确聚类，表现出明显的单系性，各分支聚类支持率分别为98%、99%和99%，采用trnL序列可以将降香黄檀、交趾黄檀和微凹黄檀木材区分开来。使用trnS-trnG序列构建系统发育树（图3），仅降香黄檀能够正确聚类，而交趾黄檀和微凹黄檀聚为一支，其识别成功率为33%。

3 讨论与结论

从木材组织中提取的DNA溶解物呈暗黑色，这与木材组织死亡过程中鞣花单宁改变有关。边材向心材组织转变过程中，木材细胞老化并导致鞣花单宁逐渐氧化和聚合，使木材DNA在提取缓冲液中着色并抑制PCR扩增反应［ 11-12］。此外，木材在长期存放过程中，受到外界环境的影响造成氧化腐朽等，也将进一步损害降解木材组织中的DNA［ 13］。利用木材组织提取的DNA扩增DNA条形码序列往往丰度较低，采用直接测序的方式往往难以得到正确结果，而采用PCR产物克隆测序的方法可大大提高测序的成功率。在该研究中3种黄檀属木材叶绿体编码基因片段trnL和叶绿体基因间隔区trnS-trnG序列的PCR扩增效率分别为82%和59%，克隆测序成功率均为100%。候选DNA条形码种间的碱基变异和插入缺失数量均高于种内。基于叶绿体编码基因序列trnL构建的系统进化树能够成功地将3种黄檀属木材区分开来。

参考文献

［1］ LOWE A J，DORMONTT E E，BOWIE M J，et al.Opportunities for improved transparency in the timber trade through scientific verification［J］.BioScience，2016，66（11）：990-998.

［2］ LOWE A J，CROSS H B.The application of DNA methods to timber tracking and origin verification［J］.IAWA journal，2011，32（2）：251-262.

［3］HASSOLD S，LOWRY P P，II，BAUERT M R，et al.DNA barcoding of malagasy rosewoods：Towards a molecular identification of CITESlisted Dalbergia species［J］.PLoS One，2016，11（6）：1-17.

［4］ 伏建國，刘金良，杨晓军，等.进口黄檀属木材DNA提取与分子鉴定方法初步研究［J］.浙江农林大学学报，2013，30（4）：627-632.

［5］ 余敏，魏宇创，张浩，等.3种木材DNA提取方法比较研究［J］.安徽农学通报，2021，27（3）：6-8，53.

［6］ 邓格求，吕叶香，余鸿发，等.刺猬紫檀木材DNA条形码鉴定研究［J］.安徽农学通报，2018，24（5）：23-25.

［7］ 李奇威，谭贵良，孙瑾，等.降香黄檀DNA提取及其rDNA-ITS序列分子系统发育分析［J］.木材工业，2016，30（3）：21-24.

［8］ 余敏，张浩，刘盛全，等.降香黄檀木材DNA提取及rDNA-ITS序列条形码分子鉴定［J］.林产化学与工业，2014，34（5）：103-108.

［9］ 王升吉，张恒木，赵玖华，等.山东玉米粗缩病病原S10序列分析［J］.玉米科学，2013，21（6）：26-30.

［10］ 岳万松，熊勇，王燕彩，等.基于ITS和IGS1序列分析对云南牛肝菌的分类鉴定［J］.食品工业科技，2015，36（8）：186-190.

［11］ DEGUILLOUX M F，PEMONGE M H，PETIT R J.Novel perspectives in wood certification and forensics：Dry wood as a source of DNA［J］.Proceedings of the royal society of london series B：Biological sciences，2002，269（1495）：1039-1046.

［12］ RACHMAYANTI Y，LEINEMANN L，GAILING O，et al.DNA from processed and unprocessed wood：Factors influencing the isolation success［J］.Forensic science international：Genetics，2009，3（3）：185-192.

［13］ JIAO J C，YU M，WIEDENHOEFT A C，et al.DNA barcode authentication and library development for the wood of six commercial Pterocarpus species：The critical role of xylarium specimens［J］.Scientific reports，2018，8：1-10.