雪茄烟叶发酵工艺及其微生物技术研究进展

刘方玉 高强 付沙 李峰 温亮 刘士峰 刘文涛 杜玉海 范增博 张丽 侯欣

摘要 雪茄烟叶的发酵在整个生产加工过程中至关重要，良好的发酵能有效改善雪茄烟叶的外观质量、化学成分以及抽吸感官等。分析了雪茄发酵的机制、意义、雪茄烟叶发酵过程中主要化学成分的变化以及雪茄发酵中的微生物及其应用，提出了目前存在的问题，并探讨了今后微生物应用发展前景，为微生物技术在雪茄发酵中的应用提供参考。

关键词 雪茄烟叶；发酵机制；化学成分；微生物技术

中图分类号 TS41+4  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2023）14-0018-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.14.005

作者简介 刘方玉（1999—），女，山东青岛人，硕士研究生，研究方向：烟草栽培与调制。*通信作者，副教授，从事烟草栽培与调制研究。

随着经济的不断发展，新型消费群体迅速发展，雪茄烟消费行为已在国内外主要经济发展区域和旅游城市逐步出现。近年来，在国家烟草专卖局支持与积极带动下，经过业界的努力，国内雪茄烟市场不断保持着较快的发展速度。但总体来说，尽管目前国内的雪茄烟市场都已经成形，但依然处在起步阶段，高端国外雪茄烟仍大量充斥着国内市场［ 1］。国产雪茄在品质上还有很大的完善空间。与烤烟烟叶不同，雪茄的烟叶是空气固化的，这种差异也是雪茄独特的风味和香气特征的主要原因，同时这种生产模式下的雪茄烟叶需要另外的步骤来延缓其中的刺激性等不良气味。发酵是雪茄生产加工中的一大重要步骤，对雪茄的众多内在品质有着有效提高［ 2］。不同的发酵方法与调控也是每种雪茄独特风味的独家技术支撑，其中微生物的应用在发酵过程中也拥有较大潜力，国内外对此都有所研究，部分厂家仍以此作为生产秘方［ 3］。因而更深层次地认识发酵原理，并研究发酵过程中微生物学的动态发展与应用，更好地利用其提升雪茄烟叶的品质至关重要。基于此，该研究分析了雪茄发酵的机制、意义以及雪茄发酵中的微生物及其应用，探讨了微生物应用面临的问题以及发展前景，以期为微生物技术在雪茄发酵中的应用提供参考。

1 雪茄烟叶发酵

雪茄烟叶发酵是指使晾制后的雪茄烟叶发生化学变化和生理变化，改善吸烟质量和加工性能，使其符合工厂加工所需的过程和方法的通称。

烟草发酵主要分两种，即自然发酵和人工发酵。自然发酵是指烟叶本身随着自然气候条件的变化而发酵。人工发酵是利用适宜烟叶发酵的条件，促进品质转化，加快烟叶发酵的方法。自然发酵需要很长时间，市场周转慢，人工发酵更加迎合市场需求。

雪茄烟叶发酵大多分一次发酵、二次发酵［ 2］两个阶段进行，一次发酵是促进烟叶成分的快速变化，主要使烟叶经历快速生化反应过程；二次发酵主要是弥补一次发酵中的不足，让烟叶再经历一次醇化的过程，使烟叶成分更加协调，改善烟叶质量，更好地满足烟叶的工业需求。雪茄烟叶发酵的具体流程分为回潮、平衡、堆垛、发酵、翻垛、拆垛几个过程。

1.1 雪茄烟叶发酵机理

实质上，烟草发酵过程是在适宜的温度湿度条件下，烟草生化特性等品质改变的过程，是工业上常用的加工方法，旨在提高烟叶的内在品质。烟叶发酵原理目前有氧化学说（氧化还原反应、美拉德反应、焦糖化反应）、酶促效应学说和微生物效应学说3种理论。可概括为：雪茄发酵技术是一种以雪茄烟叶为底物，微生物、酶以及无机元素为催化剂，以发酵技术工艺技术为化学反应要求，以发酵技术后生产的烟叶为产品的生物化学反应过程。

氧化假说主要是由涅斯列尔和什列晋格所提出的，他们都指出烟草中的无机元素在烟草发酵中起催化的功能。即烟叶的发酵过程主要是由这种无机元素作为催化剂来促进，是促使空气中氧气氧化的重要过程。微生物假说是由小什列晋格所提出的，认为在烟草发酵中，微生物在早期起了主导作用，在发酵后期则由以无机元素为催化剂的氧化作用下进行［ 4］。酶促作用假说是列夫首先提出的，他还指出，烟叶发酵主要是由于烟草中存在的氧化酶、過氧化物酶和过氧化氢酶等促使发生的酶促作用诱导的。目前普遍认为，烟叶发酵机理是化学氧化作用、酶促作用和微生物作用协同调节的结果［ 5］。

这3种作用对烟叶内在物质产生综合效应，包括分解掉不具备香味特性的高分子物质，从而合成具备香味特性的小分子结构物质，最终有效改善烟草的抽吸品质等［ 6］。

1.2 雪茄烟叶发酵的意义

发酵过程是决定雪茄成品质量的关键制造环节，是调制过程的自然延续。未经发酵的烟叶在品质上会有一些不足，例如外观上颜色不均匀，甚至含有杂色和青斑；韧性差、易破碎、易霉变。青杂气重、刺激性大、烟雾粗糙、香气不足，甚至有苦味、辣味、涩味等不良感受，不能直接用于生产，良好的发酵工艺可以提高烟叶和雪茄的品质。

1.3 雪茄烟叶发酵过程中主要化学成分的变化

烟叶的常规化学成分主要包括总糖、还原糖、钾、氯、总氮、烟碱等，这些化学成分是调控烟叶发育、调制、发酵等生理活动的主要指标，烟叶的主要化学成分是鉴定烟叶品质的重要指标，同时，还可以通过各成品之间的比重，如钾氯比、氮碱比、糖碱比等评价烟叶品质［ 7］。这些化学成分含量的协调平衡性也直接影响烟叶的品质。当前，有大量对烤烟烟叶主要化学成分与烟叶品质关系以及生产上的应用的研究，使得当前能够针对国内烤烟本土情况制定优质烤烟化学成分范围。雪茄烟叶发酵过程中化学成分的相关研究略欠于烤烟，一方面可能因为雪茄的生产模式更加复杂，尤其发酵方式不同于烤烟，温湿度的调控变化较烦琐，单方面的恒温恒湿状态下的少量样品试验对于实际工业发酵上的指导程度有一定的限制性。另一方面是雪茄发酵的堆垛方式，使其垛中各组分各部位的烟叶状态以及其中化学成分的含量分布不均匀，测定时对取材的把控与比较有一定难度。

郭文龙等［ 8］将德雪1号的茄芯烟叶进行堆垛发酵，在发酵过程中总糖含量在0.41～0.65范围内持续下降；还原糖含量在0.04%～0.15%范围内持续下降；烟碱在0.94%～1.47%范围内持续增加；氯含量在0.66%～0.87%范围内持续下降；钾含量在4.82%～5.42%范围内，前10天持续增加，10 d后下降；总氮含量在3.77%～4.45%范围内持续下降。李晶晶等［ 9］在研究发酵条件对雪茄芯叶的影响时，测得传统雪茄芯叶什烟1号在堆垛过程中烟碱含量为3.13%～3.49%。国外有相关气相色谱/质谱的研究对古巴和非古的雪茄进行了测定，其中表明非古雪茄的烟碱含量为0.27%～0.28%，古巴雪茄的烟碱含量为0.68%～0.79%［ 10］。

也有相关研究利用恒温恒湿箱对烟叶进行相对理想状态的控温发酵，例如对海南2号茄衣进行发酵，其发酵过程的烟叶总氮含量在整体范围3%～4%内呈下降的趋势；总氯在整体范围1.5%～1.8%内呈下降的趋势；糖含量在0.70%～0.85%范围内，整体较少，变化比较稳定；烟碱含量在2.0%～3.5%范围内，发酵前7天呈增加趋势，7 d后开始下降；钾含量在4%～6.5%范围内，在前14天呈递减趋势，14 d后开始增加，在21 d到达最大值后开始下降［ 11］。莫娇［ 12］在研究中测定了马杜罗茄衣发酵过程中化学成分含量，结果表示，其发酵过程的烟叶总氮含量在整体范围3.4%～4.0%内呈持续性下降，前40 d下降速率较快，后40 d下降速率减慢；总氯在整体范围0.55%～0.95%内呈下降的趋势；总糖含量在1.39%～2.60%范围内持续下降；烟碱含量在4.8%～5.2%范围内，整体呈上升趋势，前20 d增加速度较快；钾含量在2.1%～3.4%范围内持续上升；氯含量在0.52%～0.95%范围内持续下降，发酵10天内下降速度较缓，之后速率增快。另有试验在探索颜色参数与烟叶品质相关性的研究中，对恒温恒湿箱发酵过程中的德雪三号烟叶部分化学成分进行了测定，测定结果表明整个发酵过程中烟叶中的总糖、还原糖、总氮、蛋白质含量逐渐降低，尤其前10天下降较快，发酵结束4者最终含量为0.21、0.06、4.44、9.09 mg/g［ 13］。总体来看，雪茄的总糖、还原糖含量普遍较低，其他化学成分如总氮、烟碱、钾、氯等，因为种质不同、烟叶用途不同、种植和发酵条件不同等因素导致其含量均存在不同程度差异。

2 雪茄发酵中的微生物及应用

2.1 雪茄发酵微生物

在发酵过程中，微生物的动态变化可大致分为时间和空间2个研究路线。时间上主要体现在微生物的数量上，均呈不断下降的趋势，在发酵完成时只存余较少的微生物，空间上主要体现在微生物群的种类上，其中细菌尤其是芽孢杆菌等始终是发酵过程中的优势菌群［ 14］，也可能是因相对高温高湿的不同发酵环境下，微生物对于温度和酸碱度的适应程度不同，随着发酵的进行，少量能够适应高温和酸碱度等发酵环境条件的耐热微生物存活下来。

雪茄烟叶表面微生物群不断发生着变化。张晓娟［ 3］研究发现，整个发酵过程中，从起始到结束整个过程中，微生物数量减少了90%。这也可能是发酵中的高温条件消除了大量不耐热的微生物，只有部分耐热生物存活下来，并在数量上突出了其优势。从发酵前的雪茄烟叶中，共分离4个属的细菌和4个属的真菌，其中细菌以芽孢杆菌为优势种，其次為芽孢乳杆菌属，而真菌则以青霉属为绝对优势种。发酵结束后，在发酵作用的烟叶中分离出4属细菌和3属真菌。优势品种仍然是芽孢杆菌和青霉菌，但优势种减少。随着发酵的开展，在发酵前24天各种微生物数量都呈现了迅速下降的态势，24 d以后有少数微生物，大多数微生物数量已下降至0［ 15］。Di Giacomo等［ 16］对意大利托斯卡诺雪茄微生物的群体构造与动态关系进行了深入研究，结果表明发酵过程由复杂的微生物群体共同参与，并在此过程中构造与成分发生改变。在早期阶段，中等酸性和中温环境支持以汉森德巴利酵母为主的酵母种群的快速增长。在这个阶段，葡萄球菌科和乳杆菌处于优势菌群。在环境温度和pH增高时，形成了内生孢子的革兰氏阳性球菌（芽孢杆菌属）数量增多，优势变得明显。这会引起pH的进一步上升，从而促进中度耐盐和嗜酸放线菌在后期阶段的繁殖。

众多研究者对于微生物群落多样性和丰度也进行了探索。相关研究对海南光村发酵作用的茄衣及表面微生物进行了分离、提纯与鉴别，结果表明，细菌菌群为优势菌群，霉菌比例较小，且未检测到放线菌与酵母菌，且多为芽孢杆菌［ 17］。张晓娟［ 3］在发酵温度40 ℃，相对湿度70%的条件下，通过平板分离，研究发酵雪茄外包皮叶面微生物的数量，并在分离发酵生产所含微生物的过程中，探究不同发酵程度与时间的微生物即细菌、放线菌、真菌和酵母菌的数量，结果表明，没有分离出酵母菌和放线菌，且雪茄烟叶中的菌群以细菌为主。李宁等［ 18］从什邡GH-1雪茄烟叶中分离微生物，发现上部叶烟叶表面带菌量均多于中部叶及下部叶；张鸽等［ 15］对世界上不同国家雪茄外包皮烟叶表面上微生物差异开展了深入研究，结果发现由于雪茄种植地区的不同，雪茄烟叶表面上的微生物类型也有所不同，总体来看大多是以芽孢杆菌属为优势菌群，其次是葡萄球菌，且不同菌株之间的活性也存在着较大差异。

2.2 发酵过程中微生物的作用

发酵不仅是化学反应过程，而且与微生物的酶促作用有关［ 19］，在烟叶老化过程中起着极其重要的作用。

发酵期间微生物作用机理比较复杂，目前已知的首先是由自身代谢，如对糖、蛋白质进行降解，可以改善部分烟叶的香气，提高雪茄的燃烧性，并降解烟叶中的有害物质［ 20］。同时，其在自身代谢产物中也产生了芳香物质以及致香味物质的前体物和中间物质，能够用来提高烟叶香味，从而提高烟叶质量。

其次，微生物在生长发育过程中所形成的各种酶类化合物，又或是其代谢产物，它作用于烟草时可诱发或活化烟草内的各种酶系统，进而作用于烟草内的物质（主要为多糖和蛋白质），使底物完全降解，并转化成为较小分子物质的芳香化合物或各种芳香物质前体物及中间物质，它们都具有提高香味的功效［ 21］。

2.3 烟叶发酵有益微生物的国内外研究

雪茄发酵微生物的研究相对较少，更多地在于对烤烟烟叶的研究，在应用上主要通过施用微生物菌剂以及微生物酶制剂等方式，其目的主要用于降解烟草中有害成分、提升烟草品质［ 6］，也有提高发酵效率［ 22］、抑制烟叶霉变［ 23］等作用。国内外相关研究人员为提高烟叶的内在品质，对烟草发酵过程中的微生物技术进行了相关探究，如对发酵雪茄或者烤烟烟叶表面微生物进行取样、鉴定、相关生理生化分析等。

2.3.1 降解烟草有害成分有益菌属。

尼古丁是烟草的一个关键有害成分，应用微生物是一种可行的去除尼古丁的方法，Eberhardt等发现生活在烟草环境中的天然细菌和真菌菌株具有降解尼古丁的能力，这些微生物将尼古丁作为生长所需物质来源［ 24］。许多研究已经证明微生物可以降解尼古丁。截至目前，有一些微生物，包括节杆菌属［ 25-27］、假单胞菌属［ 28-31］、纤维素单胞菌属［ 28］、中间苍白杆菌［ 32-33］、红球菌属［ 34］、剑菌属［ 35］、农杆菌属［ 36］、米曲霉［ 37］、不动杆菌属和鞘胺醇单胞菌属［ 38］被报道具有降解尼古丁的能力。这些微生物通过改变最终产品的烟碱含量和治理烟碱污染，在烟草的制造过程中发挥重要作用［ 39］。

烟草特有亚硝胺是一组只存于烟叶、烟气中的致癌物质［ 40］。近年来，好氧反硝化菌备受关注并且研究较多，其中，假单胞菌属内能进行反硝化的种类最多，如铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌、施氏假单胞菌［ 41］、绿针假单胞菌、致金假单胞菌、门多萨假单胞菌［ 42］等。另有研究发现，雪茄发酵过程中褪黑素可以降低烟草亚硝胺的含量。褪黑素的特点是通过抑制微生物的亚硝化作用，降低发酵后雪茄烟叶中的亚硝胺［ 43］；Vigliotta等［ 44］发现，汉逊德巴利TOB-Y7酵母能够耐受非常高的亚硝酸盐水平并利用亚硝酸盐，在意大利雪茄发酵过程中可以有效减少亚硝酸盐和 TSNA 的积累。

2.3.2 提升烟草品质有益菌属。

烟草发酵过程中的微生物能够产生多种水解酶，如蛋白酶、果胶酶、淀粉酶等，因此微生物的活动同时主导着物质降解与转化，这些物质含量的改变也影响着烟叶品质和抽吸感官的变化。

淀粉和纤维素是烟叶的基本成分，烟叶含有50%左右的碳水化合物和5%～15%的蛋白质，碳水化合物中含有约10%～30%淀粉、10%～25%纤维素、12%果胶，这些指标的含量均影响烟叶的品质［ 19］。燃烟时，当烟叶中的成分暴露在燃烧环境中，纤维素会导致刺激性烟雾的释放，吸烟者会感到口味苦涩。一些涉及烟叶中纤维素热解产物的研究表明，烟草烟雾中已经鉴定出一些小分子醛和多环芳烃（PAHs），其中PAHs被认为具有致癌性和细胞毒性等毒性性质［ 45］。淀粉在燃烟时也会影响烟叶的燃烧速度和燃烧的完整程度，并且由于淀粉燃烧时会产生不良的焦化气味而干扰成香反应。同样，蛋白质在燃烧时也会产生使咽喉呛咳和不愉快的气味［ 19］。因此，淀粉、纤维素和蛋白质的适当降解是提高烟叶品质的关键。

李志豪等［ 46］發现，蜡样芽孢杆菌B.cereus对雪茄烟叶中半纤维素及纤维素降解具有一定作用，经菌株发酵后的雪茄烟叶能够提升叶绿醇、油酸、正二十六烷和正三十一烷等物质的含量；有研究通过烟叶浸提物培养基筛选出一株细菌HD-40，该菌属于甲基营养型芽孢杆菌，可发酵烟叶产生明显奶香味，利用该菌株发酵处理烟叶，发现其所含的酯类、醛类、酸类等对香气有贡献的成分明显增加［ 47］。利用氧化酶、果胶酶、纤维素酶等发酵制备雪茄烟叶，经过发酵后，雪茄的苦味得到明显改善，香气、烟度、口感、燃烧性和灰色等品质均有所提高［ 48-49］。也有试验从烟叶中筛选出产香芽孢杆菌并应用于烟叶发酵，发现烟叶中的酯类、醛类、酸类等香气成分显著增加［ 50］。将酵母菌和芽孢杆菌应用于烟叶的发酵时，可以降低烟叶淀粉和蛋白质的含量，同时显著提高烟叶氨基酸和石油醚提取物的含量［ 51］。研究发现，将解淀粉芽孢杆菌GUHP86和GZU03应用于发酵烟叶时，可以发现发酵后烟叶中的芳樟醇、β-大马士酮、β-紫罗兰酮等香气物质的相对含量增加［ 52］。也有应用于其他发酵过程的微生物，如酿酒酵母应用于烟草发酵可使烟草提取物中的香气物质较对照增加1倍，其中酮类、酯类、醇类等香气物质均有不同程度的增加［ 53］。

2.3.3 抑制发酵烟叶霉变有益菌属。

现有研究大多从导致烟叶霉变的微生物出发，探索主要类群、霉变机理及过程、常见霉菌的生物学特性以及可以应用于防霉的微生物的筛选与进一步探究。研究表明，高地芽孢杆菌YC-9可抑制真菌的生长，还可减少烟叶霉变，将该菌株与贝莱斯芽孢杆菌ACCC02735组合在一起可以提高雪茄发酵外观品质［ 54］；朱大恒等［ 55］从烟叶表面分离筛选出5株具有抗病性的微生物菌种在抑制霉变方面具有明显作用。研究表明，一些酵母菌剂对烟叶表面青霉菌、根霉菌的活性有明显拮抗效果［ 56］；李梅云等［ 57］筛选出部分细菌和酵母菌可诱导宿主产生几丁酶、葡聚糖酶及其他酶类，这些酶类可以通过分解病原微生物细胞壁，来抑制病原菌生长。

3 展望

关于雪茄发酵过程中微生物的相关探究，国内已有部分研究成果，但总体来说，对比国际优质雪茄烟叶，国内雪茄烟叶品质仍有很大的提升空间。对于雪茄的研究较少，而雪茄的发酵湿度、温度和持续时间也不同于烤烟，就雪茄发酵机理而言，当前的研究还无法确定3种作用分别对雪茄发酵中的哪一具体方面起主导作用，在整体调控时应如何平衡三者的关系。对于烟草发酵微生物的探究，大多聚焦于烟叶微生物群落及丰度的探索、有益微生物的筛选鉴定以及研究微生物的最优发酵工艺。而对微生物作用机理的分析、将筛选的微生物制成菌剂反施于发酵烟叶、对反施烟叶品质的具体影响等研究较少。同时微生物在发酵上的应用大多还是在实验室环境条件下的使用效果，应用于生产时，由于环境、发酵方式、雪茄品种的不同，也会有不同的影响因素和限制，有待进一步的研究。

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