野生动物笼舍环境中大肠埃希氏菌对抗生素和消毒剂的抗性分析

刘 青，郭 玲，仉 伟，赵国策，朱云芸，尹占龙，谢绪昌

（1.济南市公园发展服务中心（动物园工作部），济南，250031；2.北京动物园管理处，北京，100044）

动物笼舍环境中存在多种来自外界入侵或者内环境繁殖的细菌，不仅污染动物的生活环境，对动物健康产生潜在的威胁，还可能释放到笼舍外部，通过传播对周围环境产生影响，这一过程也成为耐药菌株在不同动物及不同生态系统间传递的重要途径。因此，做好动物饲养环境卫生、消毒等生物安全措施至关重要。消毒剂作为控制微生物感染和传播的重要方式被广泛应用［1］，然而消毒剂的长期不合理使用，也会使细菌产生耐药性从而降低杀菌效果［2］，抗生素和消毒剂之间的交叉耐药性也成为一个被广泛关注的问题［3］。

大肠埃希氏菌（Escherichia coli）广泛存在于动物笼舍的地面、墙面及栖架等处，是流行病学调查和研究的重要指示菌。本研究从4 种野生动物笼舍（猛兽馆、大象馆、猿猴馆和鸣禽馆）环境中分离大肠埃希氏菌作为受试菌，测定受试菌对常用7 种抗生素的敏感性和4 种消毒剂的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC），并对菌株携带的抗性基因进行筛选，以期为圈养野生动物抗生素、消毒剂的使用提供数据支持，为野生动物耐药性来源的探析提供参考，对改善笼舍环境卫生、保障动物健康及维护公共卫生安全具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 细菌的分离鉴定

2022 年4—7 月，对济南动物园大象馆、猛兽馆、鸣禽馆和猿猴馆4 个馆舍内的环境样本进行采样，用无菌棉签擦拭笼舍墙壁、栖架和水槽等处，放入含PBS 的1.5 mL EP 管中带回实验室，调整浓度涂布在大肠杆菌显色培养基（ECC）上，37 ℃恒温培养18～24 h，挑取蓝绿色单菌落纯化，提取细菌基因组DNA 送至北京赛默百合生物科技有限公司测序分析。

1.2 抗生素药敏试验

根据美国临床和实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）推荐的纸片扩散法检测分离菌株对临床常用7 种抗生素的敏感性，结果按照CLSI的标准判定（表1）。

表1 大肠埃希氏菌抑菌圈直径折点Tab.1 Diameter break point of inhibition zone of Escherichia coli

1.3 消毒剂最低抑菌浓度测定

参照CLSI 2017和Zou等［4］推荐的微量肉汤稀释法，测定过硫酸氢钾复合粉、二氯异氰尿酸钠粉、过氧乙酸溶液和戊二醛癸甲溴铵溶液4 种消毒剂对分离菌株的MIC。将筛选出的菌株制备成菌悬液加入到96 孔板中，并将消毒剂进行梯度稀释，最高浓度为1∶50，最低浓度为1∶25 600，每个样本重复测定 3次，以抑制细菌生长的最高稀释度作为测试消毒剂的MIC。

1.4 抗性基因筛选

利用Illumina 测序平台完成样品的基因组二代建库及测序，将服务器里的数据上传至集群并运行序列拼接，获得菌株抗性基因等信息。

2 结果

2.1 大肠埃希氏菌的分离鉴定

大肠埃希氏菌在ECC 培养基中形成边缘整齐、蓝绿色的光滑菌落，直径1～2 mm。将通过特异性培养基筛选出的菌株纯化后提取细菌基因组DNA，经16S rRNA 通用引物进行PCR 扩增，结果显示，在1 400 bp 处有明亮的目的条带（图1）。PCR 产物测序后与GenBank 中的大肠埃希氏菌序列进行比对分析，若同源性达到99%以上，则判定菌株为大肠 埃希氏菌。通过鉴定，每个馆舍分别筛选出10 株 大肠埃希氏菌，共计40 株进行后续检测，其中空气中分离3 株（7.5%），墙壁隔离网8 株（20.0%）、栖架卧床11 株（27.5）、地面15 株（37.5%）和水槽食盆 3株（7.5%）。

图1 大肠埃希氏菌16S rRNA PCR鉴定结果Fig.1 PCR identification result of 16S rRNA of Escherichia coli

2.2 药敏试验结果

40 株大肠埃希氏菌的耐药表型见表2。分离菌株对复方新诺明和氨苄西林的耐药率较高，分别为50.0%和40.0%，其次为头孢噻肟7.5%，诺氟沙星和庆大霉素的耐药率均为5.0%，对美罗培南敏感。菌株的主要耐药谱型为氨苄西林加复方新诺明。大象馆环境中菌株耐药范围最广，对4 种药物表现出耐药性，其次是猛兽馆和猿猴馆，鸣禽馆仅对2 种药物表现出耐药性。猛兽馆菌株对氨苄西林、复方新诺明和头孢噻肟的耐药率均最高，分别为70%、70%和30%。

表2 不同馆舍环境中大肠埃希氏菌耐药率Tab.2 Drug resistance rate of Escherichia coli at different cages

2.3 消毒剂最低抑菌浓度

4 种消毒剂对不同馆舍大肠埃希氏菌的MIC 值分布情况见表3。分离菌株对过氧乙酸较敏感，MIC 值为1∶1 600～1∶6 400，低于推荐使用浓度（1∶1 000）；过硫酸氢钾复合粉MIC 值为1∶400～ 1∶1 600，等于或低于推荐使用浓度（1∶400）；二氯异氰尿酸钠粉厂家推荐使用的浓度范围较大，35.0%的菌株MIC值达到1∶800，高于推荐的最低使用浓度（1∶2 000），60%的菌株MIC 值为1∶1 600，均低于推荐的最高使用浓度（1∶200）；戊二醛癸甲溴铵溶液MIC 值为1∶1 600～1∶6 400，其中17.5%的菌株MIC值为1∶1 600，接近推荐使用的最高浓度（1∶2 000）。鸣禽馆菌株对消毒剂的敏感性高于其他馆舍，二氯异氰尿酸钠粉、过硫酸氢钾复合粉和戊二醛癸甲溴铵溶液的最高MIC 值均低于大象馆、猛兽馆和猿猴馆。

表3 消毒剂MIC值分布情况Tab.3 MIC value distribution of disinfectant

2.4 抗性基因检测结果

抗性基因筛选结果显示，40 株大肠埃希氏菌共检测到29 种耐药基因，其中抗生素耐药基因有β-内酰胺类（blaTEM、blaCTX、blaACT、blaCMY和blaDHA）、喹诺酮类（qnrB、qnrS）、氨基糖苷类（aadA、aph、aac）、四环素类（tet（A）、tet（D））、磺胺及其增效剂类（sul1、sul2、sul3和dfrA）、氯霉素类（cmlA、floR）、磷霉素（fosA）、利福平（ARR）和大环内酯类（mph（A））；消毒剂抗性基因筛选出sugE、emrE、qacE、qacEΔ1、qacF、qacH和qacI；还有多药排外泵mdfA（图2）。所有菌株都携带至少1 种抗性基因，猛兽馆分离菌株携带的抗性基因最多，有28 种，其次是大象馆和猿猴馆，分别有19、11种抗性基因，鸣禽馆分离菌株携带的抗性基因最少，仅检测到5 种。所有抗性基因中mdfA的检出率最高，为92.5%，其次是tet（A）（45.0%）和sugE（42.5%）。猛兽馆分离菌株有90.0%携带消毒剂抗性基因，其他3 个馆舍消毒剂抗性基因携带率为40.0%～50.0%。

图2 不同馆舍环境中大肠埃希氏菌抗性基因筛选结果Fig.2 Resistance gene screening of Escherichia coli at different cages

3 讨论

圈养野生动物存在不同程度的耐药性，Zhu等［5］对我国13 家动物园50 种圈养非人灵长类动物中获得的995 种大肠埃希氏菌的耐药性进行调查，结果显示83.62%的菌株对至少一种抗生素具有耐药性，多重耐药性占47.94%；陆晓健等［6］从动物园中分离出69 株大肠埃希氏菌，发现大肠埃希氏菌对头孢唑林、四环素和复方新诺明的耐药率分别为41.42%、61.13%和48.28%；薛原等［7］对东北虎（Panthera tigris altaica）源大肠埃希氏菌的耐药性进行检测，发现大肠埃希氏菌对氨苄西林、四环素和复方新诺明的耐药率高达100.00%、85.12%和80.24%。抗菌药物的不合理使用是细菌耐药性产生的重要原因，圈养野生动物管理单位对抗菌药物的管理和使用存在差异，这些情况未见相关统计报告。在样本采集单位抗菌药物的使用主要是针对个体动物的抗感染治疗，部分用于小群体细菌性疾病的预防，没有作为促生长剂添加使用，因此推测圈养野生动物细菌耐药菌的产生还存在其他相关因素。Mao 等［8］对北京市环境空气中可培养细菌的细菌组成和耐药性进行研究，表明环境空气中大约1/4的细菌都是多重耐药菌，并指出这可能成为细菌间抗生素耐药性转移的潜在途径。本研究中，从圈养野生动物馆舍环境中分离的菌株对复方新诺明和氨苄西林的耐药率最高，分别为50.0%和40.0%，有研究人员从同一环境下的野生动物粪便中分离大肠埃希氏菌，并对其耐药率进行检测分析，发现耐药率最高的是磺胺类，为41.1%，其次是β-内酰胺类，为31.8%［9］，这提示耐药细菌的环境传播与圈养野生动物细菌耐药性之间存在潜在的相关性，动物的饲养环境可能对圈养野生动物耐药性的产生和发展具有很大的影响，因此开展圈养野生动物环境菌株相关监测工作是十分必要的。

细菌耐药性产生的遗传学机制分为染色体介导和质粒介导耐药性。染色体介导耐药性是基因突变产生的［10］，也叫作固有耐药性，可遗传且较为稳定；质粒介导耐药性即获得性耐药性，是细菌产生耐药性的主要机制。对现代环境细菌菌群的基因组学研究显示，各种环境下存在大量的抗生素耐药基因［11］，本研究中筛选出了29 种耐药基因，携带率较高的是mdfA及四环素类、磺胺类和β-内酰胺类。

耐药基因mdfA属于主要协同转运蛋白超家族（MFS）成员，不会产生高水平的耐药［12］，但在过量表达时可能会引起多重耐药［13］，该基因在生物化学方面有广泛的研究，但临床相关性还缺乏佐证，与本研究结果相同的是从美国零售肉中分离的大肠埃希氏菌也有较高的携带率（96.5%）［4］。四环素类药物近5 年在本研究园区没有使用记录，因此未做药敏试验。本研究中有19 株菌株携带tet基因，并在4 个馆舍均有检出，该基因在环境中广泛分布，推测与其传播方式密切相关，因为大多数tet基因都与结合或移动元素相连，可以在细菌种间或属间转移。目前发现的磺胺类耐药基因主要有sul1、sul2和sul3［14］，dfrA是编码甲氧苄啶耐药二氢叶酸还原酶的抗性基因，在革兰氏阴性菌中已知有30 多种［15］，是引起磺胺及其增效剂耐药的主要因素。超广谱内酰胺酶是革兰阴性细菌对β-内酰胺类抗生素耐药的主要机制，可以灭活青霉素、窄谱和广谱头孢菌素等。近年来，临床分离得到的细菌主要携带blaTEM和blaCTX等，在大肠埃希氏菌和肺炎菌中发现的较多，其中blaTEM型检出率总体较高，并具有诸多亚型［16］，该类基因型在本研究园区环境菌株中携带率同样较高。值得注意的是，检测到5 株头孢菌素酶耐药菌株，其中猛兽馆 4 株（blaCMY2 株，blaDHA2 株），大象馆1 株（blaACT）。头孢菌素酶是革兰氏阴性菌对头孢三代抗生素产生耐药的重要机制，应该引起重视。

消毒是控制感染的一项重要环节，可有效阻断病原微生物的传播，这是做好生物安全，预防疾病的关键。但长期使用亚致死浓度的消毒剂易导致细菌对该浓度的消毒剂产生适应效应，逐渐产生染色体或质粒的变异，最终获得遗传物质编码的耐药性并稳定遗传，表现出对消毒剂的抗性。近年来，有学者发现一些菌株对消毒剂的敏感性降低［17］，同时还发现一些与消毒剂相关的抗性基因，如位于质粒上的QAC基因家族，可以通过结合转移传递耐药性，是消毒剂抗性基因研究中最常见的基因［18］，包括qacE、qacEΔ1、qacF、qacG、qacH、qacI和sugE（p）等［19］，染色体编码基因sugE（c）、emrE、ydgE和ydgF等也特异地介导对QAC 的抗药性，并可在大肠埃希氏菌中垂直传播。本研究园区季铵盐类消毒剂没有在环境消毒中广泛使用，但在各馆舍的分离菌株中共检测到 7种相关耐药基因，来源有待进一步研究。消毒剂的规范使用至关重要，本研究中消毒剂的MIC 检测结果可作为参考，在实际应用过程中会受有机物、温度和污染物等多种因素的影响［20-21］，因此需要根据实际情况调整使用浓度，以达到较好的消毒效果。