中国两栖类物种新纪录
——德氏棘蛙

贺艳红，艾仁达，黄镇杨，张 洋，刘小龙，袁智勇

（1.西南林业大学，云南省高校极小种群野生动物保育重点实验室，昆明，650224；2.西南大学生命科学学院，淡水鱼类资源与生殖发育教育部重点实验室，重庆，400715）

Quasipaa delacouri（Angel，1928）隶属两栖纲（Amphibia）无尾目（Anura）叉舌蛙科（Dicroglossidae）棘胸蛙属（Quasipaa）［1］。该物种于1928年由Angel［2］首次报道和描述，模式产地为越南北干省（Bac Kan Province，Vietnam）。目前仅分布在越南北部（老街省、北干省、山罗省、永福省、河江省、和平省、义安省、清化省、承天顺化省和岘港市）及邻近的老挝等地区，在中国境内未发现分布［1］。2022 年7 月，在对中国云南省文山麻栗坡老山省级自然保护区的调查中，于保护区内两处地点共采集到4 号棘胸蛙属物种标本，标本现保存于西南大学淡水鱼类资源与生殖发育教育部重点实验室。采集到的棘胸蛙属物种标本经外部形态特征对比及分子系统发育关系分析，鉴定为Q.delacouri，是中国两栖动物分布新纪录。本研究描述了采集地生境、物种形态特征、分子数据及系统发育分析，为该物种的后续深入研究提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 标本采集与形态学测量

2022年7月3日，在中国云南省文山麻栗坡老山省级自然保护区内两处地点（22°50′21.41″ N，104°40′36.16″ E，海 拔1 100 m；22°50′15.90″ N，104°43′10.91″ E，海拔1 405 m）共采集到4号棘胸蛙属物种标本（标本号：SWU 0002320、SWU 0002321、SWU 0002322、SWU 0002323）。取肝脏、大腿肌肉和少许脚趾样品储存于95%乙醇中，-24 ℃保存，用于后续分子实验验证。整体标本固定于75%乙醇溶液中。

参考Pham 等［3］的测量方法，用电子数显卡尺测量标本的外部形态（测量精度为0.1 mm）。测量参数主要包括头体长（snout-vent length，SVL）、头长（head length，HL）、头宽（head width，HW）、吻 长（snout length，SL）、眼间距（interorbital space，IOS）、鼻眼距（nostril-eye length，NEL）、鼻间距（internasal space，INS）、眼径（diameter of eye，ED）、上眼睑宽（width of upper eyelid，UEW）、鼓膜径（diameter of tympanum，TD）、前臂及手长（length of lower arm and hand，LAHL）、胫长（tibia length，TIB）、足长（foot length，FT）、后肢全长（hind limb length，HLL）、指长（finger length，FL）及趾长（toe length，TL）。同时基于Angel 对Q.delacouri的形态描述［2］与本例标本进行形态比较。

1.2 分子实验与系统发育关系分析

采用Thermo Fisher Scientific 公司提供的DNA提取试剂盒对新采集的4 号标本的肌肉组织进行全基因组DNA 提取，DNA 样品-24 ℃保存。使用PCR对线粒体细胞色素b（Cyt b）基因片段扩增，引物 为Cytbyf1（5′-TTTCCGTAGACAACGCCACCCT-3′）和Cytbyf3（5′-CTAGGTTTTGATGAGGC-3′）［4］。PCR 反应程序为94 ℃预热5 min；94 ℃变性45 s，45 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，35 个循环；72 ℃终延伸7 min；4 ℃保存。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，最后由北京擎科生物科技有限公司对扩增产物 双向测序。使用LaserGene 7.0 软件包中的SeqMan对所得序列质量检测和人工校对，生成一致序列［5］。

根据Yan 等［6］对棘胸蛙属系统发育的研究结果，选取虎纹蛙［Hoplobatrachus chinensis（Osbeck，1765）］作为外群，并从GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）数据库中下载该属其他类群物种序列，共27 条（表1）。使用MEGA 7.0 对每个线粒体Cyt b序列进行比对和编辑［7］。基于最大似然法（ML）和贝叶斯法（BI）重建系统发育关系。由于线粒体Cyt b基因为编码基因，在此基础上，使用DAMBE 软件筛选密码子［8］，并使用jModelTest 2 中的AIC 标准计算序列的最佳进化模型［9］。第一位密码子和第二位密码子的最佳模型为TPM+G，第三位密码子的最佳模型为TrN+G。使用RAxML 8.2.4［10］构建最大似然树，基于默认参数，自展1 000 次估算节点支持率。使用MrBayes 3.1.2［11］进行贝叶斯系统发育分析。根据计算的最佳模型，在默认热值下使用马尔可夫链蒙特卡洛链（MCMC）执行独立运算4次，每1 000代抽样1 次，执行500 万代，散频率平均标准偏差小于0.01 达到稳定。基于收敛情况，抛弃前25%的树。使用来自MrBayes 的分裂频率平均标准差（ASDSF）和潜在尺度缩减因子（PSRF）统计数据评估拓扑收敛性和分支长度收敛性。然后使用Tracer v.1.5［12］检查各运行参数值是否收敛（ESS 值＞200）。最后使用MEGA 7.0［7］中的p-distance 双参数模型计算棘胸蛙属物种间的遗传距离。

表1 样品分子分析信息Tab.1 Sample information used for the molecular analysis

2 结果

2.1 生境

云南省文山麻栗坡老山省级自然保护区属南亚热带高原季风气候［13］，本次采集到的标本发现于海拔1 100～1 500 m 的山涧溪流中，水流急，两侧植被丰富，主要以灌木、草本植物和季风常绿阔叶林为主。在采集地附近还发现了河口湍蛙（Amolops shihaitaoi）、沙巴臭蛙（Odorrana chapaensis）、长吻臭蛙（O.nasica）和大角蟾（Xenophrys major）。

2.2 形态特征

标本各部位数据见表2。共采集到4 号棘胸蛙属标本，其中2 号为雄性成体标本（SWU 0002320，SWU 0002321），2 号为亚成体（SWU 0002322，SWU 0002323），未采集到雌性标本。新采集到的标本体型较大，成体雄性头体长为76.2～77.3 mm。头宽大于头长；吻端钝圆，突出于下唇；吻长小于眼径；鼓膜小，不明显。指端略膨大，指关节下瘤大，指式为Ⅲ＞Ⅳ＞Ⅰ＞Ⅱ。后肢长，左右跟部重叠。趾端膨大呈圆形吸盘，趾间全蹼，趾关节下瘤大，趾式为Ⅳ＞Ⅲ≈Ⅴ＞Ⅱ＞Ⅰ。

表2 麻栗坡老山省级自然保护区采集的棘胸蛙属标本形态量度Tab.2 Morphological measurement of Quasipaa specimens collected in Malipo Laoshan Provincial Nature Reserve mm

背部皮肤光滑，整体呈黑褐色，无明显褶皱。背上部分布有圆条状黑色斑纹；背下部、肛周围及两股均分布有小疣粒，肛部及周围分布有黑色角质刺。体侧部有5或6个较大的白色圆疣。咽喉部有浅棕色斑（图1）。

图1 德氏棘蛙形态（麻栗坡老山省级自然保护区，SWU 0002321，雄性）Fig.1 Morphology of Quasipaa delacouri（Malipo Laoshan Provincial Nature Reserve，SWU 0002321，male）

2.3 分子数据及系统发育分析

研究新获得4 条长度为433 bp 的线粒体Cyt b序列（GenBank 序列号为OR042806，OR042807，OR042808，OR042809）（表1），结合从GenBank 下载的23 条数据，共发现142 个简约信息位点和165 个变异位点。基于ML 和BI 法构建的系统发育结果具有相似的拓扑结构，这里仅展示贝叶斯系统发育树。在文山麻栗坡老山省级自然保护区内采集到的4 号棘胸蛙属物种标本与越南承天顺化省（Thua Thien Hue，Vietnam）和越南岘港市（Danang，Vietnam）的Q.delacouri标本聚为一支（图2）。使用p-distance 双参数模型计算遗传距离结果显示，新采集的4 号标本与Q.delacouri的遗传距离为6.5%。

图2 基于线粒体Cyt b基因构建的棘胸蛙属贝叶斯树Fig.2 Bayesian inference tree of Quasipaa derived from Cyt b sequences

3 讨论

本次新采集到的4 号棘胸蛙属物种标本形态学鉴定特征与越南北干省（Bac Kan Province，Vietnam，模式产地）的Q.delacouri的鉴定特征基本符合。头宽大于头长；鼓膜小，不明显；指端略膨大，指关节下瘤大；第一指略长于第二指；后肢长，左右跟部重叠；趾端膨大，趾间全蹼，趾关节下瘤较大。背部呈黑棕色，皮肤光滑，无明显褶皱；肛部及周围有黑色角质刺。与模式标本（头体长120 mm）相比，新采集的成体雄性标本整体形态小（头体长76.2～77.3 mm），吻长（9.5～9.7 mm）略小于眼径（11.1～11.2 mm），而模式标本的吻长（17 mm）略长于眼径（12 mm）［2］。由于描述的模式标本并未记录性别［2］，无法判断该形态差异是否因雌雄性别差异所致，且本次未采集到雌性标本，不能进一步比较判断这些差异是种群间的还是雌雄间的。同时系统发育分析结果也支持新采集到的标本为Q.delacouri，4 号标本都与Q.delacouri标本聚为一支（图2）。基于以上结果，认为新采集到的4 号标本为Q.delacouri，依据其英文别名Tonkin Spiny Frog（Tonkin 为越南北干省曾用名）［14］，将该物种的中文名定为“德氏棘蛙”。

Quasipaa delacour最早被发现于越南北部北干省［2］，之后在老挝和越南义安省、清化省及河江省 等地先后被报道过，但少有该物种的图片记录及 生境描述，尚不清楚该物种的具体繁殖时间［15-18］。Q.delacour于2022 年7 月在中国云南省文山麻栗 坡老山省级自然保护区内被发现，该保护区与相邻的越南北部地区有着相似的物种组成，对动物地 理学研究有重要意义，但在采样过程中未观察到O.delacour的抱对现象，加之考察时间较短，尚不清楚其是否进入繁殖期，因此该物种的繁殖生活史需进一步研究。

致谢：感谢文山麻栗坡老山自然保护区的工作人员对野外工作给予的帮助。