层生镰刀菌产生的有机挥发物对黄粉虫取食行为的影响

郭志青，许曼琳，张霞，李莹，迟玉成，曹建敏

(1.山东省花生研究所，山东 青岛 266100 ；2.中国农业科学院烟草研究所，山东 青岛 266101)

粮食安全直接关系到国家安全和社会稳定，储粮害虫是直接影响粮食产量和品质的重要因素之一。 储粮害虫种类多、适应性强、分布广、繁殖力高，可使储藏主粮、中药材、食品、干果等遭受巨大损失。 近年来，随着社会经济的发展，寻找绿色储粮害虫防治方法来替代化学保护剂和熏蒸剂的研究越来越受到人们的重视。

真菌挥发性物质(volatile organic compounds，VOCs)是指真菌产生的各种含碳气态化合物的混合物，具有分子量小、易挥发、能在空气和土壤中自由扩散等特性[1]。 真菌VOCs 可介导微生物和昆虫之间的生态相互作用[2-5]，如锈菌可以侵染芸苔科植物，通过改变寄主叶片形态产生真菌假花(fungal “pseudoflowers”)，真菌假花通过分泌花蜜释放花香来吸引传粉昆虫，帮助真菌完成有性繁殖；树蜂(Sirex noctilioF.)可非常敏感地躲避伴生菌(Leptographium wingfieldii)定殖的寄主植物，这表明具有相似生活史的昆虫可能通过VOCs分割宿主资源以减少竞争相互作用；白僵菌(Beauveria bassiana)侵染叶片释放的VOCs 对捕食者花蝽(Anthocoris nemorumL.)有驱避作用。真菌VOCs 也可用于食品生产:通过检测VOCs 建立模型可推测田间作物真菌侵染程度[6-8]或储存粮食和食品中的真菌腐败程度[9-11]。 因其在植物病害防治中具有独特应用价值，利用不同VOCs控制植物病虫害已成为当前国内外研究的热点。多种真菌VOCS的杀虫活性已被证实，例如，Muscodorspp.产生的挥发性有机物，包括亚硝基酰胺(nitrosoamide)，已被证明可以杀死昆虫[12]，Muscodor vitigenus产生的萘用于制造“樟脑丸”，是一种非常有效的驱虫剂[13]。

β-石竹烯(β-caryophyllene)是一种常见的萜类化合物。 β-石竹烯的药理作用主要有局部麻醉作用、治疗结肠炎、镇咳等[14]。 β-石竹烯在昆虫化学通讯中的意义已经被报道，但对于不同昆虫行为的影响不同。 比如:β-石竹烯是越冬期异色瓢虫(Harmonia axyridis)成虫的聚集素，对雌虫和雄虫都有很强引诱作用；对桃蚜(Myzus persica)和棉蚜(Aphis gossypii)有驱避作用[15，16]；对蛇麻疣额蚜(Phorodon humuli)有引诱作用[17]。 β-石竹烯目前主要从青篙、松节油中获得，而真菌产生β-石竹烯以及β-石竹烯对于黄粉虫取食行为的影响未见报道。 本研究旨在探索β-石竹烯对黄粉虫(储粮害虫)取食行为的影响。

黄粉虫(Tenebrio molitor)又称面包虫，属鞘翅目拟步甲壳粉甲属，是一种造成损失较为严重的世界性储粮害虫。 Morales-Ramos 等[18]的试验表明，黄粉虫具有从多种不同组分的食物中选择最有利于自身膳食平衡的食物的能力，由此推断黄粉虫具有能够躲避取食对本身健康造成威胁食物的能力。

前期试验发现，尽管取食真菌侵染的小麦后因为真菌毒素的污染会导致黄粉虫幼虫死亡，但黄粉虫幼虫对层生镰刀菌侵染的小麦颗粒取食具有趋向性。 我们推断这种取食趋向可能与层生镰刀菌的挥发物有关，此种挥发物对黄粉虫幼虫有吸引作用，然而具体是哪种挥发物起作用并不清楚。 本研究用层生镰刀菌21.1 侵染大米、小麦和玉米3 种基质，观察黄粉虫幼虫对3 种被侵染基质的取食反应，并运用顶空-固相微萃取(SPME)技术收集，气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)鉴定、分析层生镰刀菌21.1 在不同基质上的挥发物组分，最终明确吸引黄粉虫幼虫的有机挥发物成分，为控制仓储害虫、提高农产品品质提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

层生镰刀菌菌株21.1(Fusarium proliferatum)由山东省花生研究所分离并保存。

大米品种为稻花香，小麦品种为济麦22，玉米品种为登海605。

黄粉虫幼虫购于山东德州黄粉虫生态养殖场，于温度(26±1)℃、相对湿度70% ～80%的BSC-400 恒温恒湿培养箱内养殖，挑选发育良好、身体健壮的幼虫用做试验。

1.2 层生镰刀菌21.1 侵染不同基质

用灭菌水浸泡大米(小麦、玉米)18 h，沥水，称取20 g(玉米称取30 g)分装到灭菌的100 mL锥形瓶中，加入4 mL 灭菌水(补给高温灭菌过程中蒸发掉的水分) 后121℃高温灭菌15 min，冷却到室温。 将6 mL 层生镰刀菌孢子悬浮液(106～107个/mL)菌液接种到灭菌大米(小麦、玉米)上，混合均匀后用封口膜将锥形瓶封上；对照组用灭菌水代替孢子悬浮液。 每个处理重复3 次。 侵染后的大米、小麦和玉米28℃恒温培养7 d。

1.3 层生镰刀菌侵染的基质对黄粉虫幼虫取食影响

用记号笔将直径为14 cm 的灭菌培养皿平均分为4 个部分，称取层生镰刀菌完全侵染和灭菌没有侵染(对照)的大米各3 g，依次放在培养皿4个区域的边缘位置并确保从培养皿中心到基质的距离相等，在培养皿中心放入10 只黄粉虫幼虫(黄粉虫幼虫在试验前24 h 停止喂食)。 将培养皿放在黑暗中10 ～15 min，每次10 个重复，共进行3 次试验。 黄粉虫幼虫对层生镰刀菌侵染的小麦、玉米的取食趋向试验同上。 统计3 种基质黄粉虫幼虫在培养皿4 个不同区域的数量并进行数据分析。

黄粉虫幼虫取食偏好(%)＝目标基质所在区域黄粉虫数量之和/10×100 。

1.4 层生镰刀菌挥发性代谢产物鉴定

1.4.1 仪器与试剂 美国安捷伦7890B-5975C气相色谱质谱仪；手动萃取手柄，50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取头；250 mL 透明锥形瓶；正构烷烃(C10-C20)，购自北京百灵威科技有限公司。

GC-MS 所用条件:DB-5MS 弹性毛细管色谱柱，规格为30 m × 0.25 mm × 0.25 μm；衬管为0.75 mm SPME 专用衬管，分流比为100 ∶1；进样口温度250℃；载气为99.999%的氦气，流速为1.0 mL/min；柱温箱:初始温度50℃，保持2 min，以15℃/min 速率升至125℃，以3℃/min 速率升至170℃，最后以10℃/min 速率升至280℃，保持5 min；EI 离子源，全扫描模式，扫描范围33 ～350 amu。

1.4.2 层生镰刀菌挥发性代谢产物收集 将1.2中获得的层生镰刀菌侵染的不同基质和空白对照室温下静置0.5 h 后进行采样。 用铁架台固定萃取探针和顶空瓶，将SPME 针管刺入锥形瓶中，推动手柄杆使纤维头伸出针管。 萃取头置于锥形瓶的上部空间，采样时间为0.5 h。 收集完毕后将萃取头收起，并将针管拔出样品瓶，待GC-MS 分析。

实施过程中先采集空白对照，目的是为了排除培养基释放的挥发物和萃取头涂层流失对细菌挥发物鉴定结果的干扰。

1.4.3 吸附正构烷烃(C10-C20)探针制作 量取一定量正构烷烃(C10-C20)溶液于锥形瓶中，在室温中静置0.5 h 后，进行采样。 采样时用铁架台固定萃取探针，将SPME 针管刺入锥形瓶，推动手柄杆使纤维头伸出针管。 萃取头置于样品的上部空间，采样时间为0.5 h。 收集完毕后将萃取头收起，并将针管拔出样品瓶，待GC-MS 分析。

1.4.4 层生镰刀菌挥发性代谢物定量分析 以挥发性代谢物总离子流色谱图峰面积的相对比例表示产生代谢物的相对量。 以大米、小麦和玉米3 种基质中β-石竹烯总离子流色谱峰面积为100%，计算相同基质中层生镰刀菌其他代谢组分相对于β-石竹烯的含量。 以大米中产生的每种挥发性代谢物总离子流色谱峰面积为100%，计算小麦和玉米中挥发性代谢物相对大米中该组分的相对含量。

1.5 β-石竹烯对黄粉虫幼虫吸引的验证试验

为验证层生镰刀菌产生的β-石竹烯是吸引黄粉虫幼虫的主要成分，将β-石竹烯标准品配制成1 000 mg/L的标准品溶液，并分别添加1 mL 到盛有灭菌的大米、小麦及玉米基质的锥形瓶中。 3种基质的重量及锥形瓶的规格同1.2，密封平衡3 h 后，将空白对照基质和加入β-石竹烯处理的基质分别放在直径为14 cm 的培养皿中。 培养皿的划分及基质的放置同1.3，在培养皿的中间放入10 只黄粉虫幼虫，每次10 个重复。 将培养皿放在黑暗中10 ～15 min，统计黄粉虫幼虫在4 个划分区域的数量。 试验重复3 次。

1.6 数据统计与分析

利用Microsoft Excel 2019 进行数据整理，图表数据均以平均值±标准误表示。

2 结果与分析

2.1 层生镰刀菌侵染的基质对黄粉虫幼虫取食影响

结果(图1)表明:黄粉虫幼虫偏爱取食层生镰刀菌侵染过的基质。 层生镰刀菌侵染的基质对黄粉虫幼虫有不同程度的吸引，相较于对照，侵染大米能够吸引75%的黄粉虫幼虫；侵染小麦能吸引73%的黄粉虫幼虫；侵染玉米吸引59%的黄粉虫幼虫。 层生镰刀菌侵染的玉米吸引黄粉虫的效果相对较差。

图1 黄粉虫幼虫对层生镰刀菌侵染大米、小麦、玉米取食偏好

2.2 层生镰刀菌挥发性代谢产物分析

2.2.1 挥发物GC-MS 分析 将1.4.2 获得的吸附挥发物的萃取头在全扫描模式下进行分析，得到不同培养基质中空白对照样品挥发物、层生镰刀菌挥发性代谢物和正构烷烃(C10-C20)的总离子流图，其中大米、小麦和玉米3 种培养基质中层生镰刀菌挥发性代谢产物GC-MS 总离子流图分别见图2、图3、图4。

图3 层生镰刀菌侵染小麦基质后产生的挥发性代谢物总离子流图

图4 层生镰刀菌侵染玉米基质后产生的挥发性代谢物总离子流图

2.2.2 目标挥发物谱库检索 将层生镰刀菌挥发物总离子流图与空白样品挥发物总离子流图中共有色谱峰扣除，即为层生镰刀菌在不同培养基质下释放的挥发性特征指纹峰，使用NIST 和WILIY 谱库对特征指纹峰进行定性识别，设置匹配度阈值为80，结果见表1。 层生镰刀菌的挥发性代谢产物主要有4 种，其中β-石竹烯产量最高，其他3 种组分在NIST 和WILIY 库中匹配率虽然大于80%，但计算得到正构烷烃保留指数与文献报道相差较大，所以不能确定挥发物结构式，暂定为未知1、未知2、未知3。

表1 层生镰刀菌挥发性代谢物定性鉴定结果

2.2.3 层生镰刀菌挥发性代谢物定量分析 以大米、小麦和玉米三种基质中β-石竹烯总离子流色谱峰面积为100%，计算相同基质中层生镰刀菌其他代谢组分相对于β-石竹烯的含量。 由表2 可知，大米中未知1、2、3 组分含量均低于β-石竹烯含量的2%，小麦和玉米基质中未知组分1 所占比例高于大米，占β-石竹烯含量的30%以上，另外两种均不到β-石竹烯含量的2%。

表2 相同基质中层生镰刀菌挥发性代谢产物相对含量(以β-石竹烯为参照) (%)

以大米中产生的每种挥发性代谢物总离子流色谱峰面积为100%，计算小麦和玉米中挥发性代谢物相对大米中该组分的相对含量，结果见表3。 大米基质中层生镰刀菌产生的挥发性代谢物总量最高，其次为小麦，玉米最少。

表3 不同基质中镰刀菌侵染挥发性代谢产物相对含量(以大米为参照) (%)

2.3 β-石竹烯对黄粉虫幼虫吸引的验证试验

由图5 可知，黄粉虫幼虫偏爱取食β-石竹烯处理过的基质。 β-石竹烯处理过的基质对黄粉虫幼虫有不同程度的吸引，相较于对照，β-石竹烯处理的大米能够吸引79%的黄粉虫幼虫来取食；β-石竹烯处理的小麦能够吸引77%的黄粉虫幼虫；β-石竹烯处理的玉米吸引69%的黄粉虫幼虫。 β-石竹烯处理的基质吸引黄粉虫幼虫明显高于层生镰刀菌侵染的，这可能与层生镰刀菌侵染的基质有其他有机挥发物的干扰有关。

图5 黄粉虫幼虫对β-石竹烯处理大米、小麦、玉米的取食偏好

3 讨论与结论

本试验研究了层生镰刀菌有机挥发物对黄粉虫取食的影响。 在前期试验的基础上[19]，本试验增加了大米、玉米两种基质，结果发现层生镰刀菌侵染后的大米、小麦、玉米对黄粉虫幼虫有不同程度的吸引作用。 因此，我们推断层生镰刀菌产生的VOCs 对黄粉虫的取食有吸引作用。 运用GSMS 技术对层生镰刀菌挥发性代谢物进行定性、定量分析，初步判断层生镰刀菌吸引黄粉虫幼虫的主要有机挥发物成分为β-石竹烯。

层生镰刀菌产生的VOCs 不止本试验检测到的4 种，本研究只关注峰面积最高的物质，并在NIST 和WILIY 库中匹配判定为β-石竹烯。 此外，不同菌株的VOCs 种类不同，利用实时直接分析质谱(DART-MS)绘制的VOCs 图谱指纹显示产毒镰刀菌真菌的物种具有特异性[20]。

β-石竹烯除了药理方面作用，在环境保护、清洁空气等方面也有比较广的用途。 在工作和生活的各种环境中均存在臭氧，低浓度的臭氧对人体无害，但浓度过高会对身体产生伤害。 目前使用的空气清洁剂多为萜类化合物，由于β-石竹烯的二萜结构上含有两个双键，很容易和臭氧反应，可以很好地除去空气中的臭氧，起到净化空气的作用[21]。

本研究中层生镰刀菌的挥发物β-石竹烯对储粮害虫黄粉虫幼虫有吸引作用，对于诱杀储粮害虫有很好的应用前景。 并且，我国国家标准化管理委员会规定β-石竹烯可以用作食品用天然香料(GB 2760—2007)。 因此，β-石竹烯对人畜无害，可以作为引诱剂用于储粮害虫的防治，有效控制和降低粮食产品中储粮害虫的危害，对于提高农产品品质有重要意义。