微量元素组配对羊肚菌菌丝发育、营养品质及产量的影响

刘柱杉，孙浩翔，温嘉伟，杨大海，谭笑，夏蕾，张维东

(吉林省农业科学院农村能源与生态研究所，吉林 长春 133033)

羊肚菌(Morchella esculenta(L.) Pers.)属于子囊菌亚门(Aseomycotina)盘菌目(Pezizales)羊肚菌科(Morchellaceae)羊肚菌属(Morchella)中最著名的食用蕈菌，因其菌盖表面有不规则交叉皱褶网格似羊肚而得名[1]。 羊肚菌富含多种人体必需氨基酸，味道鲜美，因此广受美食者追捧；同时，羊肚菌也是重要的药用菌，不仅含有多糖、脂肪酸、维生素等，也是γ-型药效氨基酸的重要来源之一[2]，具有提高机体免疫力、抗癌症、抗病毒及降血脂等多种功效[3]。 目前羊肚菌的来源包括野生采摘和人工栽培，然而随着生态环境的恶化，使得野生羊肚菌越来越稀少，现今供应市场的羊肚菌主要为人工商业化栽培[1]。 有研究表明，相比于野生菌，人工栽培的羊肚菌营养成分、活性物质含量及口感均欠佳，这意味着羊肚菌的人工栽培技术仍存在许多问题，亟待探索解决[4]。

目前，关于羊肚菌的研究主要集中于人工栽培、培养基配方、发酵技术、菌核形成、多糖提取、抗氧化机制等方面[5]。 在人工栽培中，研究主要涉及培养基质对羊肚菌品质及产量的影响:如沈彤等[6]的研究表明，以生土、羊粪和菌糠组合施用可显著提高羊肚菌菌柄直径、菌柄长度、菌盖直径和单菇羊肚菌重量，子实体水分、粗纤维、必需氨基酸和呈味氨基酸含量较高，粗多糖、粗脂肪含量较低；宋崴等[7]研究发现，以草炭、香菇菌糠和有机肥组培作为培菌基质材料，土壤微生物数量(细菌、真菌、放线菌)、土壤理化性质及土壤酶活性发生显著变化，其中以香菇菌糠和有机肥组配栽培的羊肚菌钙、钾、镁含量最高。

有研究表明，矿物质养分在羊肚菌菌丝发育及品质形成等过程中亦起着重要作用[8]。 肉斯塔木·艾买提等[9]研究表明，培养营养袋基质中的氮、碳氮比可显著影响羊肚菌的出菇时间、出菇质量及产量。 王月等[10]研究发现，最适宜羊肚菌发育的碳源为蔗糖、葡萄糖和甘油，最佳氮源为硝酸钾，对氨基酸和铵盐的利用效果较差。 Ayaz等[11]研究表明，土壤中的大量元素N、K 和微量元素Fe、Mo 是影响野生羊肚菌种群密度和挥发性物质成分的重要因子。 上述研究为羊肚菌人工栽培中的施肥提供了一定的理论依据，但主要集中于碳、氮源等大量元素，对微量元素的作用鲜有涉及。 基于此，本试验研究Zn、Mn、Fe 及其组配对羊肚菌菌丝体发育、营养品质及产量的影响，以期为羊肚菌的田间微肥施用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验于2021 年11 月—2022 年3 月在吉林省农业科学院食用菌试验场进行。 供试羊肚菌物种为梯棱羊肚菌(Morchella septimelata)，采用PDA培养基接种M.septimelata纯培养物，然后在PDA培养基上于16 ～18℃超净台中进行传代培养14 d，之后转移到聚乙烯包裹菌种培养袋(300 g，70%麦麸、15%锯末、10%谷壳、1%蛭石和4%纯土)中，于16～18℃、75%湿度环境中培养15 d。

供试微肥分别为硫酸锌(ZnSO4·7H2O)、硫酸锰(MnSO4·4H2O)、硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)，均购自北京索莱宝科技有限公司。 试验地土壤类型为暗棕壤，耕层土壤理化性质为有机质含量38.59 g/kg、全氮2.09 g/kg、碱解氮116.27 g/kg、速效磷24.38 mg/kg、速效钾152.71 mg/kg，土壤含水量23%，pH 值6.56。

1.2 试验设计及方法

试验采用完全随机设计，共设置8 个处理，以不施微肥为对照(CK)。 其中，单元素处理分别为Zn、Fe、Mn；相应的组配处理分别为Zn ＋Fe、Fe ＋Mn、Zn＋Mn、Zn＋Fe＋Mn。 其中单元素处理为化合物纯量6 g/m2，双元素处理为各纯量3 g/m2，三元素组配处理为各纯量2 g/m2。 每处理重复3次。 小区面积12 m2(长4 m，宽3 m)，小区间以50 cm 宽深沟间隔。

2021 年11 月9 日菌种播前于土表撒施尿素(N 90 kg/hm2)，0～20 cm 土层用旋耕机细耕，于试验田离地2 m 正上方搭建遮阳网。 将含有大量菌核的菌种培养基质(300 g/m2)均匀撒施于土表，并覆一层细土(3 ～5 cm)，喷洒细水雾湿润表层以保证菌丝发育。 菌种播后20 d 将相应处理微肥溶于5 L 水中采用隔离式喷施，第二次喷施微肥于播种后60 d 进行，CK 喷清水。 期间不定时适量补给水分，其他管理措施同常规羊肚菌栽培。 试验周期133 d。

1.3 样品采集及测定分析

1.3.1 羊肚菌菌丝体生长测定 根据Liu 等[12]所述方法采用无菌水配制成6 mol/L 的相应微量元素化合物。 从传代培养基中挑取一环(6 mm)菌丝体于另一PDA 培养基中，按照相应处理每天加入1 mL 微量元素化合物溶液，且每天下午使用变焦立体显微镜(NSW-20P-260， Carton， Japan)观察菌核颜色和菌丝发育情况，并采用微卡尺随机测量菌丝体的延伸情况。 菌丝体日生长速率计算公式:菌丝体生长速率(mm/d)＝(菌落直径-6)/(2×培养天数)[13]，本研究中菌丝生长测定时间为7 d。

1.3.2 羊肚菌氨基酸成分含量测定 成熟期采收羊肚菌子实体(菌盖和菌柄)，并用去离子水小心、仔细清洗。 将子实体在55℃烘箱中烘干至恒重并粉碎处理，相关氨基酸组成及其含量测定参考熊丙全等[14]的方法略有修改。

准确称取约100 mg 样品于水解管中，加入6 mol/L 分析纯盐酸4 mL，采用氮吹仪吹入纯氮气15 min 后封管。 将封口的水解管置于110℃保温箱中水解24 h，之后取出冷却至室温开管，采用去离子水定容至50 mL。 准确吸取1 mL 定容液，采用氮吹仪二次吹氮，在60℃条件下吹脱至干燥。加入0.02 mol/L HCl 溶液2 mL，采用液漩涡器充分混匀，过0.26 μm 有机膜小柱，终液采用全自动高速氨基酸分析仪(L-8900， Hitachi， Japan)测定。

1.3.3 羊肚菌产量与相关营养成分含量测定羊肚菌多糖含量参照NY/T 1676—2008 标准测定，粗纤维参照GB/Y 5009.10—2003 标准测定，粗脂肪参照GB/Y 5009.6—2016 标准采用酸水解法测定，粗蛋白参照GB/Y 5009.5—2016 标准采用凯氏定氮法测定。 产量以小区子实体收获的干物质重换算而成。

1.4 数据处理与分析

采用Microsoft Excel 2010 整理数据，采用SPSS 23.0 软件统计分析，显著性检验采用邓肯氏多重比较法(α ＝0.05)，采用Origin 2018 软件绘图。

2 结果与分析

2.1 微量元素及其组配对羊肚菌菌丝体发育和菌核形成的影响

由表1 看出，不同微量元素处理均可提高羊肚菌菌丝体的生长速率，其中含Mn 各处理表现较好，Mn、Fe＋Mn、Zn＋Mn、Zn＋Fe＋Mn 处理较CK分别显著增加21.83%、23.81%、19.77%、21.29%，且各处理的菌丝活力均较强。 单施Mn 处理，菌株最早形成菌核(第9 天)，CK 和Zn＋Mn 处理菌核形成较晚，分别为第16 天和第15 天，各处理菌核出现时间由早到晚的顺序为Mn＞Zn＋Fe＋Mn＞Fe＋Mn＞Zn＋Fe＞Fe＞Zn＞Zn＋Mn＞CK。 此外，在菌核颜色中，所有微量元素组配处理的菌核颜色较单施处理更深。

表1 微量元素及其组配对羊肚菌菌丝体生长和菌核形成的影响

2.2 微量元素及其组配对羊肚菌菌丝体和菌核形态的影响

由图1 看出，在羊肚菌菌株发育过程中，菌核首先在复杂交错的菌丝网中形成，随后慢慢壮大；菌核最初是白色的，成熟后颜色由淡黄色变为棕色(图1A～D)，在菌核(以白色棉花球的形状存在)覆盖培养基表面之前，培养基中生长的菌丝体短而密集(图1E)、疏而直立(图1F)、密集而丛生(图1G)，最后菌丝完全覆盖于培养基表面，在立体显微镜下还观察到菌核表面有许多短的垂直菌丝体(图1H)。 在变焦立体显微镜下观察到的菌丝体晶亮、形态宽、扁平，且呈螺旋状扭曲，但各处理菌丝形态无显著差异(图2)。

图1 羊肚菌菌丝和菌核形态

图2 微量元素及其组配对菌丝形态的影响

2.3 微量元素及其组配对羊肚菌氨基酸类型的影响

2.3.1 对羊肚菌氨基酸成分含量的影响 由表2可知，在羊肚菌中检测到的7 类人体必需氨基酸(EAA)组分中，以亮氨酸(Leu)含量较高，但除甲硫氨酸(Met)外，各EAA 组分含量差距较小。 总EAA 含量各处理表现为Mn＞Zn＋Fe＋Mn＞Fe＋Mn＞Zn＋Mn＞Zn＋Fe＞Fe＞Zn＞CK，与CK 相比，各微量元素处理增幅为1.25%～10.87%，且Mn、Fe＋Mn、Zn＋Mn、Zn＋Fe＋Mn 处理分别显著提高10.87%、7.93%、6.12%、8.38%。 在10 类人体非必需氨基酸(NEAA)组分中，谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、精氨酸(Arg)是组成NEAA 的主要成分，三者总和占总NEAA 含量的56.16%～59.14%。 总NEAA含量表现为Mn＞Zn＋Fe＋Mn＞Fe＋Mn＞Zn＋Mn＞Fe、Zn＋Fe＞Zn＞CK，其中Zn 处理与CK 无显著差异，其余各处理较CK 显著增加2.09%～6.73%。各处理总氨基酸含量规律与总NEAA 规律基本一致。

表2 微量元素及其组配对羊肚菌氨基酸成分含量的影响 (%)

2.3.2 对羊肚菌中呈味氨基酸含量的影响 羊肚菌的鲜味来自于天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)，甜味主要来自丝氨酸(Ser)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)。 由图3A 可知，鲜味氨基酸总量以Mn 处理最高，CK、Zn、Fe、Zn＋Fe、Fe＋Mn、Zn＋Mn、Zn＋Fe＋Mn 较其分别降低1.18、0.89、0.82、0.69、0.62、0.96、0.76 个百分点。由图3B 可知，甜味氨基酸总量以Zn＋Fe＋Mn 处理最高，显著高于其他处理，而其他各处理表现为Mn＞Fe＋Mn＞Zn＞Zn＋Mn＞Fe＞Zn＋Fe＞CK，但处理间均无显著差异。

图3 微量元素及其组配对羊肚菌中呈味氨基酸含量的影响

2.3.3 对羊肚菌中药用氨基酸含量及EAA/NEAA 值的影响 药用氨基酸类型主要包括赖氨酸(Lys)、亮氨酸(Leu)、甲硫氨酸(Met)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)、甘氨酸(Gly)、精氨酸(Arg)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)。 由图4A可知，不同微肥处理间羊肚菌中药用氨基酸含量存在一定差异，其含量占总氨基酸含量的62.70%～65.15%，谷氨酸(Glu)和天冬氨酸(Asp)是药用氨基酸的主要成分。 不同处理间，药用氨基酸含量表现为Mn＞Fe＋Mn＞Zn＋Fe＞Zn＋Mn＞Zn＋Fe＋Mn＞Fe＞CK＞Zn，其中Mn 处理显著大于CK、Zn 处理。 由图4B 可知，与CK 相比，施用微量元素均可提高羊肚菌EAA/NEAA 值，增幅为1.11%～4.01%，其中，以Mn、Fe＋Mn、Zn＋Mn 处理的EAA/NEAA 值较高，三 者无显著差异但均显著大于CK、Zn、Fe 处理。

图4 微量元素及其组配对羊肚菌中药用氨基酸含量及EAA/NEAA 值的影响

2.4 微量元素及其组配对羊肚菌营养成分含量的影响

由图5 可知，羊肚菌中各营养成分含量因微量元素处理不同而表现出较大差异。 其中粗多糖含量以施Mn 相关处理较高，且表现为Mn＞Zn＋Mn＞Zn＋Fe＋Mn＞Fe＋Mn；与CK 相比，上述处理粗多糖含量分别增加1.64、1.58、1.11、0.90 个百分点，其中Fe＋Mn 与CK 无显著差异(图5A)。 由图5C 可知，各处理粗脂肪含量由高到低表现为Zn＋Fe＋Mn＞Mn＞Fe＞CK＞Fe＋Mn＞Zn＋Mn＞Zn＋Fe＞Zn，但处理间均无显著差异。 粗蛋白、粗纤维含量皆以Fe＋Mn 处理含量最高，Fe＋Mn 处理粗蛋白较其他处理增加0.48%～7.27%，粗纤维含量则增加6.16%～15.89%，且Fe＋Mn 处理两指标值均显著高于CK(图5B、D)。

图5 微量元素及其组配对羊肚菌营养成分含量的影响

2.5 微量元素及其组配对羊肚菌子实体产量的影响

由图6 可知，施用微量元素均提高了羊肚菌子实体产量，各处理间表现为Fe＋Mn＞Zn＋Fe＋Mn＞Zn＋Fe＞Fe＞Zn＋Mn＞Mn＞Zn＞CK。 与CK 相比，微量元素各处理产量提高3.79%～15.37%，与Fe＋Mn 处理相比，CK、Zn、Mn、Zn＋Mn、Fe、Zn＋Fe、Zn＋Fe＋Mn 分别降低13.32%、10.04%、9.23%、8.50%、5.17%、4.05%、3.69%。 此外，Fe＋Mn 处理与CK差异显著，且二者分别与其他处理均无显著差异。

图6 微量元素及其组配对羊肚菌子实体产量的影响

3 讨论与结论

微量元素是生物体生长过程中不可或缺的矿质养分，可改善生物体细胞原生质的胶体化学性质，提高和改善相关生物体的生长、产量与品质[15]。 锌(Zn)、铁(Fe)、锰(Mn)是羊肚菌子实体含量较高的3 种微量元素，但目前关于三者对羊肚菌菌丝发育及产质的功能作用知之甚少[16]。本研究结果表明，在Zn、Fe、Mn 及其组配处理与CK 之间菌丝特征没有明显差异，但微量元素处理均不同程度促进了菌丝体的生长和菌核的形成，这表明Zn、Fe、Mn 对羊肚菌孢子萌发及菌丝发育均发挥着积极作用。 这与前人研究结果基本一致:即Fe、Mo 是影响野生羊肚菌繁殖的重要土壤因子[11]。 此外，研究结果进一步表明，含Mn 处理(Mn、Fe＋Mn、Zn＋Mn、Zn＋Fe＋Mn)对菌丝生长速率、菌丝活力及菌核形成的积极效应更优，且Fe＋Mn 处理最优，表明Fe 与Mn 存在协同作用。

在氨基酸营养品质的质量评价中，人体必需氨基酸(EAA)的组成与含量是评价其营养品质的重要参考[17]。 本研究结果表明，CK 与微量元素处理的氨基酸组成丰富、种类齐全，但各氨基酸含量、比重高低不一，且甲硫氨酸(Met)、异亮氨酸(Ile)、苯丙氨酸(Phe)含量均较低，这种氨基酸组成含量会显著影响氨基酸的整体利用率，导致其他EAA 在体内不能被充分利用而产生浪费[14，18]。 整体而言，各处理总EAA 含量表现为Mn＞Zn＋Fe＋Mn＞Fe＋Mn＞Zn＋Mn＞Zn＋Fe＞Fe＞Zn＞CK，且含Mn 处理(Mn、Fe＋Mn、Zn＋Mn、Zn＋Fe＋Mn)较CK 显著提高6.12%～10.87%。

WHO/FAO 中，氨基酸组成模式是进行营养评价的重要标准，被广泛用于各类食用菌的营养评价分析[19]。 根据FAO/WHO 推荐标准，人体必需氨基酸与非必需氨基酸(NEAA)的比例(EAA/NEAA)需高于0.465[20]。 本研究结果中，EAA/NEAA 为0.450 ～0.468，其中Mn、Zn＋Mn、Fe＋Mn分别为0.468、0.467、0.466，表明Mn 及其与Zn 或Fe 组配施用更有利于提高EAA/NEAA 值。 此外，药用氨基酸、鲜味氨基酸和甜味氨基酸总量整体以含Mn 处理较高，表明施用Mn 肥可提高羊肚菌中呈味氨基酸含量，提高药用价值，这是羊肚菌爽口、味道鲜美及保健效果较好的重要原因。

微量元素是重要催化酶、大分子物质及香味物质的重要媒介[21]，因此可影响羊肚菌的营养品质。 本研究中，Mn、Fe＋Mn 处理下粗多糖、粗蛋白和粗纤维含量整体较高，表明二者处理有利于提升羊肚菌的食用口感；同时粗脂肪与CK 无显著差异，这可满足健康食品的要求。 产量是反映羊肚菌生长、养分总含量及保障经济收入的重要指标。 本研究中，各处理产量由高到低依次为Fe＋Mn＞Zn＋Fe＋Mn＞Zn＋Fe＞Fe＞Zn＋Mn＞Mn＞Zn＞CK，即微量元素均可提高羊肚菌子实体产量，但仅Fe＋Mn 处理较CK 产量显著提高15.37%。

综上，Mn 肥对羊肚菌早期菌丝发育及最终营养品质均有重要作用，整体而言Mn 与Fe 组配(Fe＋Mn)效果最佳，其可有利于菌丝体发育和菌核形成，羊肚菌子实体氨基酸营养价值及营养品质效果较佳，且可保障产量提高。