新型聚合物包膜尿素配施黄腐酸对棉花叶绿素荧光动力学特征及产量的影响

孙桂琴，刘德春，王见华

(1.江西农业工程职业学院，江西 樟树 331200；2.江西农业大学农学院，江西 南昌 330045)

棉花是世界范围内种植最广泛的纤维作物，也是支撑地方税收的重要经济作物之一。 目前，我国棉花种植区主要分布于长江中下游、黄淮海和西北内陆棉区[1]。 近年来随着粮食作物和蔬菜种植面积扩大，三大棉花种植区的规模明显缩小[2]。 因此，如何在有限的植棉区提高棉花产量已成为促进棉花生产的有效途径。

黄腐酸(FA)是一种水溶性低分子量有机酸，吸附水量大、性质稳定，具有疏松土壤、增湿养墒及防旱等优点[3，4]，有利于种子发芽、增加幼苗存活率、诱导植株地上部横向发育和减轻根部生长阻力，从而提高植物对水分和养分的吸收[5]。 此外，FA 可调节气孔开合和蒸腾速率以调控光合作用，且可分解为小分子的芳香族羟基羧酸进入类囊体，诱导膜内外产生质子浓度差和膜电位差，驱动光反应系统的非循环电子传递，从而提高光合效率[6]。

氮(N)是生命体必需的矿质养分，在植物遗传物质、生理代谢以及产质形成方面发挥着不可替代的作用[7]。 对棉花而言，生长早期充足的氮供应可促进棉株根系和叶片快速发育以及后期产量形成，因此棉花对氮肥的需求量较大[8]。 然而，在棉花生产中，施氮量与产量间存在阈值，当氮肥施用过多时作物的氮肥利用率反而降低，目前作物氮肥利用率仅30%～35%[7]。 大量施入氮肥和不当施用方式会导致土壤退化、温室气体排放和地下水污染风险骤增等环境生态影响[9]。此外，尿素分次施用比一次性施用人工成本明显增加，从而大大降低棉花的种植效益。 因此，优化氮肥投入并减少环境污染已成为棉花生产的重要瓶颈[10]。 大量研究显示，施用控释肥可显著促进棉花的生长发育、光合作用及提高产量收益。 目前，生产中已经应用的多种缓释和控释肥料，主要为新型聚合物包膜尿素类、硫包衣尿素类和甲醛聚合物尿素类[11-13]。

光合作用是绿色植物叶绿体通过光反应和暗反应过程将光能转化为有机物并释放氧气的过程，是绿色植物发育代谢的基础。 快速叶绿素荧光动力学曲线(OJIP)主要反映PSⅡ的原初光化学反应、光合机构和状态等变化[14]。 快速叶绿素荧光诱导动力学分析(JIP-test)是以生物膜能量流动为基础建立的分析方法，通过JIP-test 能够获知环境条件对PSⅡ供体、PSⅠ受体及其反应活性的影响[15]。 近年来，随着对叶绿素荧光技术研究的深入，人们逐步认识到OJIP 曲线可提供大量的生理信息。 目前，OJIP 曲线主要应用于优适植被筛选、病理学表征、环境污染以及非生物胁迫光系统分子机制研究等领域[16]，对养分供应下的荧光动力学及相关光合生理特征鲜有涉及。 基于此，本研究探索黄腐酸与新型聚合物包膜尿素和常规尿素配施对棉花叶绿素荧光动力学相关特征及产量的影响，以期为新型尿素与黄腐酸在棉花生产中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验于2021 年4—10 月在江西农业大学棉花试验农场(115°55′02″E，28°46′05″N)进行。 试验园区属亚热带湿润季风气候，年日照时数1 560.5 h，年均日照总辐射103.56 kJ/cm2，无霜期约271 d，年均降水量1 657～1 663 mm，2021 年4—10 月平均气温28.7℃。 供试田块平整，土壤类型红壤，前茬作物为棉花(Gossypium hirsutumL.)。 田块0 ～30 cm 表土理化性质为:pH 5.58，容重1.31 g/cm3，有机质含量26.16 g/kg，碱解氮、有效磷、速效钾含量分别为87.22、69.75、114.52 mg/kg。

1.2 试验材料

供试材料为江西省主栽棉花品种科能0518(转基因抗虫棉)。 所用黄腐酸(FA)为典型的农用肥料，纯富里酸含量497.3 g/kg；常规尿素(N 46%)购自江西九江心连心化学有限公司；新型聚合物包膜尿素(N 46%，山东金正大生态工程有限公司制造)由淀粉、乙基纤维素涂层构成，内部尿素主体包含氨基酸、腐殖质和海藻提取物，制备工艺见Ricardo 等[17]所述。 新型聚合物包膜尿素在25℃土壤中的N 释放寿命约4 个月，已成熟地应用于棉花生产[10]。 磷肥为棉花专用钙镁磷肥(P2O533%)；钾肥为氯化钾(K2O 60%)。

1.3 试验设计

采用双因素随机完全区组设计。 常规尿素(conventional urea)和新型聚合物包膜尿素(polymer-coated urea)，分别标记为CU 和PU。 共设置5 个处理:CK(不施氮肥，不施黄腐酸)、CU(施用常规尿素)、CU＋FA(常规尿素结合施用黄腐酸)、PU(施用新型聚合物包膜尿素)、PU＋FA(新型聚合物包膜尿素结合施用黄腐酸)。 每处理重复3次，共15 个小区。

试验于4 月19 日开沟穴播，采用双脊覆盖种植:大行距80 cm，小行距50 cm，株距30 cm。 小区面积57 m2，种植密度67 500 株/hm2。 肥料施用比例为m(N)∶m(P2O5) ∶m(K2O)＝6 ∶5 ∶6，纯氮总用量均为180 kg/hm2。 氮素分2 次施用(基肥60%，花铃期追肥40%)；黄腐酸施用量180 kg/hm2，亦分2 次施用，50%的基肥为黄腐酸颗粒肥，50%的花铃期追肥为水溶喷施。 各小区管理同常规丰产大田。

1.4 测定项目及方法

采用植物效率分析仪Handy-PEA(Hansatech， UK)测定叶片叶绿素荧光诱导动力学曲线(OJIP)和光反射曲线。 每小区选择5 株棉花，取其倒4 叶避开主叶脉约1.5 cm 处进行测定，使用荧光仪配备的专用叶夹进行30 min 充分暗适应。OJIP 曲线由3 000 μmol/(m2·s)红光诱导，测定时间为1 s。 OJIP 曲线上的O、J、I、P 四个特征点分别对应0、2、30、500 ms 的时间点，对应的相对荧光强度(F)分别表示为Fo、FJ、FI和Fm。 OJIP曲线上0.15 ms 和0.3 ms 的对应时间点分别定义为L 和K，对应的相对荧光强度分别表示为FL和FK，不同时间点的相对荧光强度表示为Ft。 快速叶绿素荧光动力学分析(JIP-test)参数的计算参见邢玉美[16]、里程辉[18]等所述，相关参数及其生物学意义见表1。

表1 JIP-test 中的参数、公式及生物学意义

为进一步研究不同处理间OJIP 曲线的特异性，需对O-P、O-J 和O-K 进行标准化。 标准化过程中设Fo为0，将Fm、FJ、FK的相对荧光强度定义为1，标准化曲线中特征点L、K、J 和I 对应的相对可变荧光强度(V)分别用VL、VK、VJ和VI表示。 将不同处理的VO-P、VO-J、VO-K与CK 作差值，分别以ΔVO-P、ΔVO-J、ΔVO-K表示。 PSⅠ反应中心的活性由820 nm 光反射曲线△I/Io的初始反射斜率表示，其中Io和△I 分别代表820 nm 光反射曲线的最大值及最大值与最小值之差[19]。

产量构成因子相关指标测定。 每个小区调查群体密度。 每处理随机选取30 株具代表性植株统计单株棉铃数及棉铃总数。 棉铃自然风干后测量单铃重和衣分。 按小区分别收获籽棉并折算出公顷产量，结合衣分数据计算皮棉产量。

1.5 数据统计与分析

采用Microsoft Excel 2013 进行数据整理，采用SPSS 24.0 软件进行双因素方差分析和最小显著差法(LSD)分析(P＜0.05)，采用Origin 2018 软件绘图。

2 结果与分析

2.1 不同处理对棉花叶片叶绿素荧光动力学曲线的影响

快速叶绿素荧光动力学曲线(OJIP)能够反映光化学系统的电子传递及活性特征，可准确反映光反应中PSⅡ供体侧、受体侧和反应中心电子的氧化还原状态。 由图1 看出，随时间推移各处理整体皆呈上升趋势。 与CK 相比，尿素与黄腐酸处理(CU、CU＋FA、PU、PU＋FA)在Fo和FJ处差距较小，FI、Fm处整体均表现为PU＋FA＞PU、CU＋FA、CU＞CK，PU＋FA 处理的Fm值最大。

图1 不同处理下棉花叶片叶绿素荧光动力学曲线(OJIP)

2.2 不同处理对棉花叶片OJIP 曲线标准化特征的影响

通过将原始OJIP 曲线上Fo的相对荧光强度定义为0，将点P、J 和K 的相对荧光强度定义为1对其进行标准化。 由图2 可知，与CK 相比，相关施肥处理(CU、CU＋FA、PU、PU＋FA)的标准化OP 曲线上2 ms 处J 点的相对荧光强度VJ和30 ms处I 点的相对荧光强度VI呈现上升趋势，且VJ的上升幅度明显大于VI(图2A、B)。 标准化O-J 和O-K 曲线上0.3 ms 处VK点的相对荧光强度和0.15 ms处VL点的相对荧光强度也呈上升趋势(图2C-图2F)。 各处理间VK和VI比较发现，与常规尿素相关处理(CU、CU＋FA)相比，新型尿素处理(PU、PU＋FA)下的ΔVO-J和ΔVO-L值明显更高；且CU、CU＋FA 处理之间的差异相对较小，而PU＋FA 处理下的ΔVO-J和ΔVO-L值都明显高于PU 处理。

图2 不同处理棉花叶片标准化特征曲线(A、C、E)及其与CK(B、D、F)的差异比较

2.3 不同处理对棉花叶片OJIP 曲线特征点可变荧光强度的影响

对各特征点相对可变荧光强度进行定量分析表明(图3)，各肥料处理(CU、CU＋FA、PU、PU＋FA)下，VJ、VI、VK和VL值均整体呈下降趋势，但各特征点参数下降幅度不同。 与CK 相比，CU 和CU＋FA 处理的VJ、VI、VK和VL数值降幅较小，且CU 处理的4 个参数值与CK 无显著差异；PU 和PU＋FA 处理的VJ值分别较CK 显著降低38.11%和45.91%，VL值分别显著降低7.45%和14.14%。PU 处理的VI和VK值与CK 相比无显著差异，PU＋FA 处理的VI和VK值显著小于CK。

图3 不同处理棉花叶片VJ(A)、VI(B)、VK(C)和VL(D)

2.4 不同处理对棉花叶片PSⅡ光化学活性的影响

由图4 可知，在相应施肥处理下，植物叶片中PSⅡ反应中心活性有关参数(Fv/Fm、PIabs、PItotal)值皆明显上升。 CU 处理的Fv/Fm和PIabs与CK相比差异不显著；CU＋FA 处理的Fv/Fm和PIabs较CK 分别显著增加25.39%和98.60%；CU 和CU＋FA 处理的PItotal与CK 无显著差异。 PU 和PU＋FA 处理的Fv/Fm、PIabs、PItotal值均显著高于CK，且PU＋FA 处理的PIabs和PItotal显著高于其他处理。 各施肥处理下棉花叶片RC/CSm值明显增加，各处理间表现为CK＜CU＜CU＋FA＜PU＜PU＋FA。 其中，CU、CU＋FA、PU 处理间差异不显著，PU ＋FA 处理的RC/CSm值较CK 显著提高82.12%。

图4 不同处理棉花叶片Fv/Fm(A)、PIabs(B)、PItotal(C)和RC/CSm(D)

2.5 不同处理对棉花叶片叶绿素荧光调制反射信号的影响

由图5A 可知，各处理诱导下820 nm 光反射信号的趋势存在一定差异。 施肥相关处理(CU、CU＋FA、PU、PU＋FA)下820 nm 光反射信号的波动振幅均降低。 其中，PU＋FA 处理的波动趋势与CK 间明显分离，其他施肥处理(CU、CU＋FA、PU)与CK 比较波动则相对较小。 红光照射时820 nm处的△I/Io是反映PSⅠ活性的重要参数。 △I/Io的定量分析发现(图5B)，CU 处理的△I/Io与CK无显著差异，CU＋FA、PU 和PU＋FA 处理的△I/Io分别较CK 显著上升54.26%、86.88%和141.84%，其中PU＋FA 处理的△I/Io值显著大于CU＋FA 处理。

图5 不同处理下叶片MR820nm(A)和△I/Io(B)调制反射信号变化

2.6 不同处理对棉花产量的影响

总成铃数、单铃重及衣分是棉花产量(籽棉产量、皮棉产量) 构成三要素。 表2 显示，不同处理对产量构成因子单株成铃数、总成铃数、单铃重和衣分的影响表现基本一致:整体均表现为CK＜CU＜CU＋FA＜PU＜PU＋FA。 除衣分外，单株成铃数、总成铃数、单铃重均表现为PU 和PU＋FA 处理显著高于CK。 各处理籽棉产量和皮棉产量均表现为CK＜CU＜CU＋FA＜PU＜PU＋FA。 CU＋FA 处理籽棉产量和皮棉产量均显著高于CU，PU＋FA处理均显著高于PU。 PU＋FA 处理籽棉产量和皮棉产量较CU、CU＋FA、PU 分别显著提高22.64%、10.99%、8.97%和23.31%、11.60%、9.42%。 尿素因子与黄腐酸因子在籽棉产量中存在显著交互作用，在皮棉产量中存在极显著交互作用。

表2 不同处理对棉花产量及其构成因子的影响

3 讨论与结论

3.1 不同处理对棉花叶片OJIP 曲线趋势特征的影响

本研究结果表明，不同尿素类型及其配施黄腐酸均改变了棉花叶片OJIP 曲线趋势特征，提高了叶片30 ms 时的I 相荧光值(FI)和500 ms 时的P 相最大荧光值(Fm)。 相关尿素与黄腐酸处理(CU、CU＋FA、PU、PU＋FA)均不同程度增加了叶片Fv/Fm、PIabs和PItotal值，表明尿素和黄腐酸皆提高叶片PSⅡ反应中心活性。 黄腐酸可进入类囊体，诱导膜内外产生动作电位，从而可驱动光合电子传递[6，20]，这与本研究结果一致。 此外，各处理单位面积内反应中心的数量(RC/CSm)表现为CU＜CU＋FA＜PU＜PU＋FA，表明尿素配施黄腐酸可激活棉花叶片的光化学反应。 常规尿素、新型聚合物包膜尿素处理(CU、PU)的Fv/Fm、PIabs、PItotal和RC/CSm增幅均低于尿素配施黄腐酸处理(CU＋FA、PU＋FA)，PU ＋FA 处理各参数值增幅最大。上述结果表明，新型聚合物包膜尿素可影响棉花叶片PSⅡ反应中心活性，且配施黄腐酸影响效果更明显。

3.2 不同处理对棉花叶片OJIP 曲线标准化特征的影响

对各处理原始OJIP 曲线进行标准化处理发现，尿素和黄腐酸相关处理(CU、CU ＋FA、PU、PU＋FA)的叶片VJ、VI特征值较CK 降低。 VJ代表PSⅡ受体侧受破坏程度，VI表征光合作用电子传递链上从半醌(QA)到还原型醌(QB)的电子传递受阻程度[21]。 VJ、VI特征值降低表明相关尿素与黄腐酸处理可有效促进半醌离子(Q-A)由QA传递到QB[22]，同时表明施肥影响扩散性质体醌(PQ)库异质性[23]。 本试验条件下，与CK 相比，新型聚合物包膜尿素处理(PU、PU＋FA)的VJ、VI降幅大于常规尿素处理(CU、CU＋FA)，且PU＋FA处理降幅均大于PU。 这表明新型聚合物包膜尿素和黄腐酸有助于将PSⅡ受体侧电子从QA转移至QB。

3.3 不同处理对棉花叶片OJIP 特征点可变荧光强度的影响

叶绿体中类囊体膜的稳定性在维持植物正常生理功能及光合反应方面起着重要作用[22，24]。VL、VK分别是类囊体膜流动性、受损程度的重要指标，二者越低表明膜功能越完善、结构越完整[25]。 本研究结果表明，常规尿素处理(CU、CU＋FA)和新型聚合物包膜尿素处理(PU、PU＋FA)的VL、VK值均低于CK，处理间VK值表现为PU＋FA＜PU＜CU＋FA＜CU＜CK，处理间VL值表现为PU＋FA＜CU＋FA＜PU＜CU＜CK。 说明新型聚合物包膜尿素比常规尿素更有利保障光合进程，且配施黄腐酸效果更佳。

光合作用是干物质积累和植株形态建成的重要保障，生长早期良好的光合作用有利于植株形态建成，而生长中期良好的光合作用可有效保障作物产量形成[26]。 一些研究发现，PSⅠ比PSⅡ更能反映光合作用电子传递和光合磷酸化水平[27]，当PSⅠ活性降低时，从PSⅡ到PSⅠ的电子传输往往被抑制，这反过来会对PSⅡ造成损伤[20]。 在红光照射过程中，820 nm 处光信号(△I/Io)是反映PSⅠ活性的重要指标[19，27]。 本研究中，常规尿素处理(CU)下△I/Io与CK 无显著差异，而其他处理(CU＋FA、PU、PU＋FA)的△I/Io值较CK 均显著上升，且PU ＋FA 处理提升幅度最大。 说明新型聚合物包膜尿素(PU、PU＋FA)和常规尿素配施黄腐酸(CU＋FA)处理均可有效提高棉花叶片中PSⅠ活性。 Fv/Fm、PIabs、PItotal是表征植物叶片中PSⅡ反应中心活性的重要参数。 本研究结果发现，不同处理下Fv/Fm、PIabs和PItotal的变化趋势与△I/Io整体一致。 表明新型聚合物包膜尿素及黄腐酸也可有效提高叶片PSⅡ光反应中心活性，且新型聚合物包膜尿素配施黄腐酸效果更明显。

3.4 不同处理对棉花产量的影响

籽棉产量、皮棉产量是棉花生长发育和收获指数的重要表征[28]。 本研究中，各处理下单株成铃数、总成铃数、单铃重及衣分的变化规律基本相同，即PU＋FA 处理均高于其他处理，CK 各产量构成因子值均最低，说明新型聚合物包膜尿素配施黄腐酸处理最有利于棉花发育和产量形成。 前人研究表明，养分供应不足条件下，植株光合作用及碳水化合物合成减缓[29]。 这与本研究结果一致。 总成铃数、单铃重及衣分是棉花产量构成关键因子。 本研究中，各处理衣分无明显差异，但棉花总成铃数、单铃重皆表现为CK＜CU＜CU＋FA＜PU＜PU＋FA。 且PU＋FA 处理总成铃数和单铃重均显著高于其他处理，这是PU＋FA 处理籽棉产量和皮棉产量均显著高于其他处理的主要原因。

综上，施用新型聚合物包膜尿素或与黄腐酸配施均可在一定程度上改善棉花叶绿素荧光动力学曲线特征，提高棉花叶片光合系统Ⅱ(PSⅡ)和光合系统Ⅰ(PSⅠ)反应中心活性，且新型聚合物包膜尿素配施黄腐酸(PU＋FA)效果最优；新型聚合物包膜尿素配施黄腐酸(PU＋FA)可显著增加总成铃数和单铃重，籽棉产量和皮棉产量较其他施肥处理(CU、CU＋FA、PU)分别显著提高8.97%～22.64%和9.42%～23.31%。