溴氰虫酰胺对小菜蛾幼虫肠道真菌群落的影响

陈华璋，郑苹，田旭，汪汉成，向立刚，李文红

(1.贵州省农业科学院旱粮研究所，贵州 贵阳 550006；2.贵州省烟草科学研究院，贵州 贵阳 550081；3.长江大学农学院，湖北 荆州 434000；4.贵州省农业科学院植物保护研究所，贵州 贵阳 550006)

昆虫体内微生物与其生命活动密切相关，影响昆虫的交配[1]、对寄主植物的选择[2]、昆虫寿命[3]以及对病原菌的抵抗力[4]等。 小菜蛾[Plutella xylostella(L.)]是危害十字花科作物最为严重的害虫之一，常导致甘蓝、西兰花、芥菜、油菜、萝卜和花菜等多种重要蔬菜严重的经济损失[5]。肠道是其重要的生命器官，栖息着大量的微生物，其中细菌的丰富度和多样性较高。 目前，已报道的小菜蛾肠道细菌有蒙氏肠球菌(Enterococcus mundtii)、粘质沙雷菌(Serratia marcescens)、肉杆菌(Carnobacterium maltaromaticum)等[6-8]。 这些肠道细菌对食物的消化、宿主的生长发育与环境适应性均起着积极作用[6，8]。 相较而言，有关小菜蛾肠道真菌群落的研究较少。

当前，化学方法是防控小菜蛾最为经济有效的手段。 溴氰虫酰胺为双酰胺类杀虫剂，以昆虫鱼尼丁受体为靶标，导致昆虫细胞无限制释放钙离子，使其肌肉麻痹、瘫痪、停止取食，最终死亡[9，10]。 该药剂自2012 年上市以来便被广泛应用于小菜蛾的防治，且效果良好[11]。 杀虫剂在发挥其作用的同时也影响着昆虫肠道微生物的组成和生理代谢活动[12，13]；同时部分肠道微生物也影响着宿主对包括农药在内的有害物质的降解[14]、抗药性的产生[15]以及抵御病原微生物的入侵[16]等。 前期研究发现溴氰虫酰胺浸叶饲喂小菜蛾，其肠道厚壁菌门和肠球菌属相对丰度均显著降低，而蓝细菌门和血杆菌属相对丰度均显著增加，同时小菜蛾肠道细菌群落多样性、均匀度和丰富度整体呈增加趋势，且多样性和丰富度增幅显著(待发表)。 但该药剂是否对小菜蛾肠道真菌群落结构存在影响尚不清楚。 微生物纯培养方法为传统研究技术，能顺利获得后续研究的微生物菌株材料[17]，高通量测序技术虽不能获得活的菌株材料，但能够较为全面了解肠道微生物菌群组成与多样性特征[18]。 将两种技术相结合用于小菜蛾肠道真菌的研究可以更全面地了解小菜蛾肠道真菌菌群结构与多样性特征，从而深入探寻溴氰虫酰胺浸叶饲喂处理对其肠道真菌群落的影响规律。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试小菜蛾为溴氰虫酰胺敏感品系，由贵州省农业科学研究院植物保护研究所昆虫研究室长期室内饲养。 97%溴氰虫酰胺(cyantraniliprole)原药由美国杜邦公司生产。 PDA 培养基(HB0233-12，青岛海博生物技术有限公司)，DNA 提取试剂盒(DP307，TIANGEN)。

1.2 试验方法

1.2.1 基于传统分离培养法的小菜蛾肠道真菌群落研究 前期研究发现溴氰虫酰胺对小菜蛾的半致死浓度(LC50)为0.143 mg/L。 本研究用含0.1% Triton X-100(T8200，Solarbio)的无菌水配制1 mg/L 溴氰虫酰胺药液，浸泡新鲜甘蓝叶片30 s后取出晾干至表面无水痕，放入小菜蛾饲养盒中，并接入生长一致的3 龄小菜蛾幼虫，以相同体积的含0.1% Triton X-100 无菌水处理甘蓝叶片饲喂的小菜蛾幼虫作为对照。 12 h 后，从对照组和溴氰虫酰胺处理组中分别随机挑选健康且大小一致的小菜蛾幼虫100 头，饥饿4 h 后置于75%乙醇中体表消毒90 s，再用0.8%生理盐水冲洗3 次，最后在超净工作台上解剖挑取肠道。 肠道组织放入2 mL 无菌离心管中4℃保存备用。

向离心管中加入1 mL PBS 缓冲液(P1022，Solarbio)后使用组织研磨器进行充分研磨，随后用PBS 缓冲液将研磨液分别稀释成10-1、10-2、10-3。 分别取50 μL 上述不同浓度稀释液均匀涂布于含1%硫酸链霉素(S8290，Solarbio)和氨苄青霉素钠(A8180，Solarbio)的PDA 培养基上，每个浓度3 次重复，置于28℃恒温培养箱黑暗培养7 d。 期间每天观察培养基上菌落的生长情况，一旦有新菌落出现，便从菌落边缘挑取菌丝转接至新的PDA 培养基上进行纯化。 对纯化后的菌株进行编号，并接种于PDA 斜面培养基上，4℃冰箱保存备用。

使用真菌基因组DNA 提取试剂盒提取纯化菌株的DNA，基因组经稀释后，以ITS1/ITS4 为引物扩增其转录间隔区ITS 区，PCR 反应条件及体系参考吴燕燕等[17]的方法。 扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，测序结果在GenBank 数据库中进行BLASTn 比对分析。

1.2.2 基于高通量测序技术的小菜蛾肠道真菌群落研究 按1.2.1 方法处理小菜蛾，对照组和溴氰虫酰胺处理组分别随机挑选小菜蛾幼虫200头，收集肠道组织。 采用土壤基因组DNA 提取试剂盒(DP336，TIANGEN)提取小菜蛾幼虫肠道微生物总DNA，每样品取100 头幼虫肠道，每组重复2 次(对照组:SCK1、SCK2；溴氰虫酰胺处理组:SJY1、SJY2)。 随后采用超微量分光光度计检测其质量与浓度。 以检测合格的DNA 为模板，采用ITS1F 和ITS2 通用引物进行PCR 扩增，扩增体系与程序参考苏日娜等[19]的方法。 扩增产物经纯化后送至北京诺禾致源生物科技有限公司，采用PacBio Sequel 平台进行三代扩增子测序。

首先通过QIIME2(2019.4)软件qiime cutadapt trim-paired 程序切除序列的引物片段，弃去未匹配引物的序列；DADA2 进行质控、去噪、拼接、去嵌合体；采用classify-sklearn 算法[20]将过滤后的序列与UNITE 数据库进行物种分类学注释；使用qiime feature-table rarefy 功能，对样品中的序列进行抽平，用于后续Alpha、Beta 多样性分析等；运用R 语言和ggplot2 包计算样品微生物群落香 农( Shannon)[21]、 辛 普 森( Simpson)[22]、Chao1[23]、测序深度指数(Observed species)、皮诺(Pielou)[24]和覆盖度(Good’s coverage)[25]等Alpha 多样性指数；通过R 语言、ape 包等基于Bray-Curtis距离[26]进行Beta 多样性分析及主坐标分析(PCoA)；使用FunGuild 对真菌群落进行功能预测分析。

2 结果与分析

2.1 溴氰虫酰胺对小菜蛾幼虫肠道可培养真菌的影响

由表1 可知，溴氰虫酰胺处理显著增加了小菜蛾肠道可培养真菌种类，但明显降低了真菌总数。 对照组共获得57 株真菌，溴氰虫酰胺处理组共获得22 株真菌。 根据真菌的形态及分子鉴定，对照组的57 株真菌分别为青霉菌(Penicilliumsp.，42 株)和盾壳霉菌(Coniothyriumsp.，15 株)；溴氰虫酰胺处理组的22 株真菌分别属于曲霉菌(Aspergillussp.，4 株)、青霉菌(Penicilliumsp.，8株)、盾壳霉菌(Coniothyriumsp.，6 株)和黄瓜织球壳菌(Plectosphaerella cucumerina，4 株)。

表1 小菜蛾肠道可培养真菌分类及统计

2.2 溴氰虫酰胺对小菜蛾肠道真菌群落的影响

2.2.1 数据质控及OTU 聚类 Illumina NovaSeq测序得到原始数据经过拼接和质控处理之后，溴氰虫酰胺处理组2 个样本共得到93 616 条高质量序列，25 595 467 个碱基，序列平均长度分别为266、280 bp，序列中GC 含量分别为50.48%、50.68%，测序错误率小于0.01(Q20)和0.001(Q30)的碱基数分别占总碱基数的92.32%、86.13%和91.73%、85.23%。 对照组中2 个样本共得到131 208 条高质量序列，35 074 595 个碱基，序列平均长度分别为277、259 bp，序列中GC含量分别为51.79%、51.81%，测序错误率小于0.01(Q20)和0.001(Q30)的碱基数分别占总碱基数的93.55%、87.87%和95.17%、90.51%(表2)。

表2 样本测序数据统计及质控

在97%的相似度水平下对样品序列进行OTU 聚类，如表3 所示，溴氰虫酰胺处理组中2 个样本共鉴定得出真菌10 门，33 纲，80 目，159 科，271 属，380 种；对照组中2 个样本共鉴定得出真菌10 门，35 纲，82 目，163 科，279 属，397 种。

表3 各样本真菌群落不同分类水平下数目

2.2.2 ITS 序列测序深度分析 稀释曲线(rarefaction curve)是描述组内样本多样性的重要工具，可以直接反映测序数据量的合理性，并间接反映样本的物种丰富程度。 本试验中两组共4 个样品在测序数据为33 000 时曲线趋于平缓(图1)，说明此次测序数据深度已经足够，能够反映样品中大多数的真菌多样性信息，进一步测序对新OTU 的产生贡献不大。 因此，本研究测序量能反映小菜蛾肠道真菌群落的组成情况。

图1 OTU 水平稀释曲线

2.2.3 小菜蛾肠道真菌群落组成 在门水平上溴氰虫酰胺处理组和对照组的优势菌门均为子囊菌门(Ascomycota)，其次是担子菌门(Basidiomycota)；经溴氰虫酰胺处理后的小菜蛾肠道上担子菌门丰度显著低于未处理组，其他真菌种类无显著性差异(图2)。 溴氰虫酰胺处理组和对照组中相对丰度前10 的菌门分别是子囊菌门(80%/77%)、担子菌门(4%/18%)、毛霉门(Mucoromycota，0.04%/0.27%)、被孢霉门(Mortierellomycota，0.25%/0.17%)、 罗 兹 菌 门(Rozellomycota，0.10%/0.06%)、油壶菌门(Olpidiomycota，0.05%/0.08%)、壶菌门(Chytridiomycota，0.05%/0.04%)、球囊菌门(Glomeromycota，0.03%/0.02%)、捕虫霉门(Zoopagomycota，＜0.01%)和Aphelidiomycota(＜0.01%)。

图2 小菜蛾肠道真菌门水平群落组成

在属水平上，平脐蠕孢属(Bipolaris)为绝对优势菌，其次为镰刀菌属(Fusarium)和散尾鬼笔属(Lysurus)。 溴氰虫酰胺处理组和对照组相对丰度前10 的真菌属中平脐蠕孢属(66%/41%)、镰刀菌属(3.9%/18%)、散尾鬼笔属(2.9%/16%)、枝孢属(Cladosporium，0.6%/3.5%)、赤霉菌属(Gibberella，0.5%/2.3%)、链格孢属(Alternaria，0.8%/1.7%)、曲霉属(Aspergillus，0.3%/0.9%)和Pseudopithomyces(0.1%/0.9%)为二者共有菌属；Archaeorhizomyces和伊萨酵母属(Issatchenkia)仅存在于溴氰虫酰胺处理组中，相对丰度分别为2.9%和0.5%，帚枝霉属(Sarocladium)和毕赤酵母属(Pichia)仅存在于对照组中，相对丰度分别为1.1%和0.7%(图3)。

图3 小菜蛾肠道属水平真菌群落组成

2.2.4 小菜蛾肠道真菌群落Alpha 多样性 由表4 可知，溴氰虫酰胺处理后小菜蛾肠道真菌群落的丰富度(Chao1、ACE 指数)、测序深度指数(Observed species)、系统发育多样性指数(PD wholetree)均增加，除PD whole tree 指数外，与对照组无显著性差异，Simpson 指数和Good’s coverage指数均有所下降。 对照组中小菜蛾肠道真菌群落Shannon、Simpson 指数分别为3.9±0.2、0.82±0.04，Chao1、ACE 指数分为980±88、993±46，Observed species 指数为830±13，PD whole tree 指数为473±14，Good’s coverage 指数为0.995±0.001；溴氰虫酰胺处理组中小菜蛾肠道真菌群落Shannon、Simpson 指数分别为3.9±0.7、0.67±0.09，Chao1、ACE 指数分别为1 505±561、1 324±287，Observed species 指数为1 096±129，PD whole tree 指数为745±64，Good’s coverage 指数为0.993±0.003。

表4 真菌群落Alpha 多样性指数

2.2.5 小菜蛾肠道真菌群落Beta 多样性 PCoA主坐标分析表明，对照组2 个样品与溴氰虫酰胺处理组2 个样品距离较远，真菌群落组成差异较大；对照两样品间距离较小，真菌组成差异较小，而溴氰虫酰胺处理组的SJY1 和SJY2 样品之间距离较远，表明其真菌群落组成差异较大(图4)。

图4 基于Weighted Unifrac 距离PCoA 分析

2.2.6 小菜蛾肠道真菌FunGuild 功能预测 真菌FunGuild 功能预测(图5)表明:溴氰虫酰胺处理组和对照组小菜蛾肠道真菌群落的主要功能包括植物病原菌(Plant Pathogen，67%/45%)、未指定的(Unassigned，17%/7%)、植物病原-土壤腐生微生物-木材腐生微生物(Plant Pathogen-Soil Saprotroph-Wood Saprotroph，4%/18%)、粪便腐生微生物-土壤腐生微生物(Dung Saprotroph-Soil Saprotroph，3%/16%)、未定义的腐生微生物(Undefined Saprotroph，3%/5%)、内生植物病原(Endophyte-Plant Pathogen，0.6%/3.6%)、动物病原-内生菌-植物病原-木材腐生菌(Animal Pathogen-Endophyte - Plant Pathogen - Wood Saprotroph，0.8%/1.7%)。

图5 FunGuild 功能注释相对丰度柱形图

3 讨论与结论

肠道中真菌群落相比细菌群落所占比例较小，但其对于肠道菌群稳态至关重要[27]。 本研究通过传统分离培养技术从未经溴氰虫酰胺处理的小菜蛾肠道中分离出了青霉属和盾壳霉属真菌，而从溴氰虫酰胺处理的小菜蛾肠道中还分离出了曲霉属真菌和黄瓜织球壳菌。 江宇航等[28]从云南松毛虫肠道中也分离出了曲霉菌属和青霉菌属，但其分离到的根霉菌、镰刀菌和念珠菌等本试验未获得，而高通量测序结果表明小菜蛾肠道中存在相关菌属，可能由于分离培养基和培养条件的差异未能分离出纯菌株。 青霉菌作为常见的产纤维素酶菌株[29]，可帮助宿主更好地消化植物组织。 研究表明青霉属、曲霉属和镰刀菌属均可作为昆虫肠道共生真菌，为宿主的生长发育和繁殖提供营养物质[30]。 黄瓜织球壳菌可导致甘蓝[31]、土豆[32]、番茄[33]等作物发生萎蔫。 此次在小菜蛾肠道中检测到黄瓜织球壳菌可能是因为其作为病原菌附着在甘蓝叶上，最后因取食进入肠道。

高通量测序结果表明，平脐蠕孢属、镰刀菌属、散尾鬼笔属、枝孢属、赤霉菌属、链格孢属、曲霉属和Pseudopithomyces为肠道中优势真菌属。其中平脐蠕孢属可引起玉米[34]、水稻[35]和狗尾草[36]等禾本科植物的叶斑病，但尚未有其导致甘蓝感病的报道；镰刀菌属作为一种常见菌属，可以是有益菌、病原菌以及中性菌；散尾鬼笔属是可形成大型子实体的真菌；枝孢属、赤霉菌属和链格孢属中均包含大量植物病原菌。 食物是肠道微生物的重要来源，因此小菜蛾肠道中包含了大量植物病原菌菌属，虽然多数并非甘蓝病原菌，但由于降雨和风力等自然因素也会导致其它植物的病原菌散播到甘蓝叶上，最终进入到小菜蛾肠道中。 功能预测结果表明小菜蛾肠道中真菌群落主要为植物病原菌，其次为土壤木材腐生微生物以及植物内生菌，这也印证了小菜蛾肠道中的真菌多来自食物和土壤等。

溴氰虫酰胺处理后小菜蛾肠道平脐蠕孢属的相对丰度显著增加，镰刀菌属、散尾鬼笔属相对丰度显著降低。 物种群落方面，溴氰虫酰胺处理后小菜蛾肠道真菌群落丰富度指数、系统发育多样性指数等均有不同程度的上升。 PCoA 的结果也证明了这一点，经溴氰虫酰胺处理后不同小菜蛾肠道真菌群落样本距离较远，物种组成差异较大。这可能是由于溴氰虫酰胺作用使得小菜蛾的防御机能降低，环境中的大量微生物群落进入到了小菜蛾肠道中，相关假设将在后续试验进一步验证。

本研究检测了溴氰虫酰胺处理后小菜蛾肠道真菌群落结构的变化，结果显示溴氰虫酰胺处理后小菜蛾肠道真菌群落数量和多样性均有不同程度的增加。 研究结果为小菜蛾肠道微生物功能的研究提供了借鉴，同时也为溴氰虫酰胺与小菜蛾的互作研究提供了参考。