对肥胖小鼠血浆外泌体miRNA表达谱的分析及联合超声生物显微镜评价肥胖小鼠左室心肌收缩功能障碍的效果

马 鑫，徐 静，刘罗娜，王 琴*

（1.宁夏医科大学总医院心脏中心功能检查部，宁夏 银川 750004 ；2.山东省立第三医院，山东 济南 250000；3.西安交通大学第二附属医院，陕西 西安 710004）

肥胖是冠心病等心血管疾病的重大独立危险因素，是全球性的公共健康问题，已经给医疗系统带来了巨大的负担[1]。防治肥胖引起的心脏病已经成为亟待解决的重大健康问题[2]。有研究指出，肥胖患者在早期就会表现出心脏结构和功能的改变[3]。然而常规超声技术常常无法检测出肥胖早期左室心肌功能的亚临床改变，不能精确评估肥胖心脏功能障碍，并且临床上对于肥胖所致心脏功能改变的机制尚不清楚，因此对肥胖早期心肌损伤尚无良好的诊断方法与治疗方案。外泌体(Exosomes) 是机体被激发或发生损伤时产生的30 ～150 nm 的囊泡状物质，其中包含多种蛋白质、非编码RNA 等[4]。有研究指出，外泌体内含有大量的microRNA、lncRNA、circRNA 等非编码RNA，并且可以传送到受体细胞，进而发挥一定的生物学效用[5]。因此探究外泌体在心血管疾病发展过程中的作用具有重要的临床意义。本文主要是采用超声显微镜心肌应变技术检测肥胖小鼠左心室收缩功能的亚临床改变，应用芯片测序等方法观察肥胖小鼠与正常小鼠心脏miRNA 表达的差异，探讨差异表达miRNA在肥胖心肌受损发生发展过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选择20 只6 周大的雄性C57BL/6 小鼠（体重20 ～30 g），喂食高脂肪饮食。选择10 只体重和Lee指数大于对照组平均值±1.5 倍标准差的肥胖小鼠模型作为肥胖组，将其余10 只与肥胖组年龄和性别相同的C57BL/6 小鼠作为对照组。涉及这些动物的操作得到了宁夏医科大学总医院伦理委员会的批准。

1.2 超声生物显微镜检测

将小鼠用2% 异氟醚麻醉，仰卧位固定在恒温平台上，四肢固定在ECG 电极上进行ECG 记录。在成像前使用化学脱毛剂去除胸毛，并在麻醉开始后和心率稳定时收集超声心动图数据。采用超声生物显微镜动态观察小鼠的左心室超声生物学变化，包括形态学、血流动力学、功能和应变的变化。形态学改变包括左室间隔厚度和左室内径，以M 型超声测量左室间隔厚度、左室后壁厚度、左室收缩末期内径（Ds）和左室舒张末期内径（Dd），用Teichholtz 校正公式计算左室射血分数（EF）。在乳头肌的短轴部分测量径向和周向应变，用软件自动跟踪心内膜以生成整体心肌应变曲线，进而导出每个部分的心肌应变参数。

1.3 外泌体提取与鉴定

取两组小鼠的血液10 ～15 mL，加入15 mL 无酶离心管中，以3000 rpm 室温离心10 min ；将上清液倒入50 mL 的离心瓶中，放入落地式离心机中，在4 ℃下以16 000 g 离心30 min ；最后在冰上用50 µL的甲基纤维素液处理10 min。调节合适的焦距及亮度并拍照。使用纳米颗粒跟踪分析仪对外泌体颗粒的直径进行测量。

1.4 miRNA 测序

对于外泌体的miRNA 进行测序（miRNA-seq），采用LC Sciences（美国）进行标记miRNA-seq 文库的制备、测序和下一代测序（NGS）数据的分析。利用Illumina Hiseq 2500 SE50 平台对该文库进行测序。使用读取次数高于数据集平均拷贝数的标准来筛选高水平miRNA。将R 软件包multiMiR（版本3.12）用于miRNA 靶扫描和预测，并使用R 软件包clusterProfiler 对靶基因进行聚类分析。总RNA用TRIzol 试剂（日本Takara 9109）进行分离。该文 库 用Illumina NovaSeq 6000 PE150 测 序。应 用|logFC| ＞1 和P＜0.05 标准筛选差异表达的基因。基因本体论（GO）、京都基因和基因组百科全书（KEGG）的分析采用R 软件包clusterProfiler 进行。结果用GO plot 进行可视化。

1.5 心肌冰冻切片免疫荧光染色

进行冷冻切片复温，以4% 多聚甲醛进行固定。固定后，切片可在4 ℃的PBS 中储存3 个月。使用封闭溶液封闭细胞。进行一级抗体结合，在室温下培养过夜。以PBST 冲洗3 次。进行二级抗体结合，在室温下避光培养。以PBST 冲洗3 次。加入1 滴封闭剂，密封载玻片，并用荧光显微镜检查。

2 结果

2.1 超声生物显微镜检查结果

二维超声参数比较：对照组与肥胖组的左室收缩末期内径、左室射血分数相比，差异无统计学意义（P＞0.05）；肥胖组的左室间隔厚度、左室后壁厚度、左室舒张末期内径均大于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表1。超声生物显微镜二维斑点追踪技术测量结果显示，对照组和肥胖组的长轴应变、径向应变、圆周应变参数相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）；肥胖组的长轴应变、径向应变参数均低于对照组，肥胖组的圆周应变参数高于对照组。见表2。

表1 一般资料与二维超声参数的分析（± s）

表1 一般资料与二维超声参数的分析（± s）

注：*相较于对照组，P ＜0.05。

参数 对照组 肥胖组初始体重(g) 21.93±1.20 21.46±1.14最终体重(g) 31.15±2.17 36.19±3.66*左室间隔厚度(mm) 0.60±0.037 0.71±0.044*左室后壁厚度(mm) 0.62±0.053 0.72±0.033*左室舒张末期内径(mm) 4.3±0.30 4.6±0.31*左室收缩末期内径 (mm) 2.8±0.30 2.8±0.29左室射血分数(%) 70.05±4.75 70.15±4.55

表2 二维斑点追踪技术数据分析（± s）

表2 二维斑点追踪技术数据分析（± s）

注：*相较于对照组，P ＜0.05。

应变参数 对照组 肥胖组长轴应变 22.04±2.89 7.35±1.3*径向应变 23.49±3.08 16.00±2.11*圆周应变 20.10±2.00 29.84±2.67*

2.2 心肌冰冻切片免疫荧光染色

NLRP3 抗体免疫荧光染色显示，肥胖组NLRP3的表达明显增多。

2.3 血浆外泌体miRNA 的测序和生物信息学分析

对原始数据进行过滤和质检后，对并集差异miRNA 进行层次聚类分析。两组样本间共检测到455 个差异表达的miRNA，肥胖小鼠与正常小鼠相比有124 个下调，331 个上调。为了继续探究肥胖小鼠与正常小鼠差异miRNA 的功能，使用GO 和KEGG数据库对这些靶基因进行了功能和通路富集分析，有效富集的筛选标准为Q value ≤0.05。对靶基因的GO 富集分析分为细胞组分、分子功能和生物进程三类。在生物过程富集中，这些基因主要参与细胞代谢、增殖和死亡等过程。它们的分子功能富集在转录活性和信号转导活性调节上。同时，对这些靶基因参与的信号通路进行了KEGG Pathway 注释分类。在生物进程中，这些靶基因主要参与生物过程、信号转导等，调控细胞的生长和死亡，运输和代谢。在细胞成分中，细胞膜、细胞质占主要部分。在分子功能上，主要功能包括蛋白质结合、金属离子结合及核苷酸结合。另外，差异表达miRNA 靶基因在心血管系统、免疫系统、神经系统等多个系统都有富集。值得注意的是，NF-κB 是肥胖小鼠血浆外泌体中表达升高较为显著的信号通路之一，其与炎症小体NLRP3 的水平、肥胖心脏内炎症反应密切相关。

3 讨论

本项研究中，我们采用C57BL/6 小鼠建立了肥胖模型。C57BL/6 小鼠予以高脂喂养后，可导致肥胖相关代谢异常，引起心肌损伤，如果不及时进行干预可使其发展至心力衰竭阶段，这与肥胖人群心肌疾病发生的规律十分相似。研究中发现肥胖组小鼠的心肌明显增厚。有研究表明，室间隔明显增厚是心脏发生重塑最为敏感的观察指标[6-10]。二维斑点追踪技术克服了心肌角度依赖性，可以提供多方向的心肌形变信息。心肌应变参数是评估心室整体或局部功能的有效指标。与短轴应变参数的变化相比，纵向应变参数与血流动力学改善的关系更为密切。此指标与心脏重塑密切相关。在本研究中，虽然肥胖小鼠的左室射血分数正常，但二维斑点追踪超声心动图（2D-STE）已经检测到其早期的左室心肌收缩功能障碍。本试验提取两组血液进行测序发现，两组样本间有455 个差异表达的miRNA，肥胖小鼠与正常小鼠相比有124 个下调，331 个上调。使用GO 和KEGG 数据库对这些靶基因进行功能和通路富集分析发现，这些基因主要参与细胞代谢、增殖和死亡等过程。它们的分子功能富集在转录活性和信号转导活性调节上。同时，对这些靶基因参与的信号通路进行了KEGG Pathway 注释分类。其中NF-κB 信号通路是肥胖小鼠血浆外泌体中表达升高较为显著的信号通路之一。有研究表明，NF-κB 是炎症反应的“总开关”，NLRP3 炎症小体的激活受到NF-κB 的严格调控。在本研究中，与对照组小鼠相比，NLRP3 在肥胖组小鼠的左室心肌中的表达显著增强。有研究指出，NLRP3 炎症小体与细胞内神经酰胺增加的脂毒性相关，其可在巨噬细胞和脂肪组织中诱导caspase-1 的裂解。在肥胖的啮齿类动物模型中，caspase-1 信号通路和纤维化信号通路的显著增强与左室功能的显著降低相关。进一步明确心肌细胞NF-κB-NLRP3 调控通路在肥胖早期心肌损伤中的作用及其相关机制，并以此为靶标研究肥胖所致代谢性疾病的防治具有重要的意义。