无并发症2 型糖尿病与早期糖尿病肾病患者肠道菌群特异性分析

孙雅娴 田雨昕

肠道菌群与人类互惠共生,辅助宿主维持正常生理功能,其构成和数量一定程度上可以反映宿主的健康状态。目前研究［1］显示,肠道菌群参与肥胖、感染、糖尿病等的发生发展。糖尿病对人体的危害主要表现在糖尿病的并发症,在糖尿病患者中,有25%～40%的患者将发展为DKD,这类患者心血管疾病的发病率和死亡率也大大增加［2］。DKD 的发病机制复杂,目前认为是多因素综合作用的结果,糖尿病患者一旦进展为DKD,病情无法逆转。肠道菌群作为糖尿病重要的环境影响因素,对其并发症的发生发展也起到了重要作用,对无并发症T2DM 与早期DKD 患者肠道菌群的特异性深入研究,有可能找到糖尿病进展为DKD 的诊断依据与治疗靶点。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取大连大学附属新华医院内分泌科2021 年9 月～2022 年3 月就诊的23 例无并发症T2DM患者作为T2DM 组,29 例早期DKD 患者作为DKD 组,20 例健康体检者作为对照组。T2DM 组男11 例,女12 例；平均年龄(55.87±6.46)岁。DKD 组男14 例,女15 例；平均年龄(56.17±5.51)岁。对照组男10 例,女10 例；平均年龄(53.10±5.19)岁。三组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。

1.2 诊断及排除标准 ①符合1999 年WHO 2 型糖尿病诊断标准；②尿微量白蛋白/Cr 30～299 mg/g 持续时间>3 个月。排除糖尿病急症,其他类型肾脏疾病,合并肝胆、血液系统、其他内分泌疾病；近2 周内未服用微生态制剂,无腹泻。

1.3 方法

1.3.1 临床资料收集及血脂、肾功能、血常规指标检测 记录三组研究对象的糖尿病病程、BMI、血压(收缩压、舒张压)。HITACHI 全自动生化分析仪检测三组研究对象的FPG、TC、TG、LDL-C、HDL-C、UA、Cr。血细胞全自动分析仪XN1000 检测血常规,包括PLT、lymph-cell、NLR。

1.3.2 粪便菌群多样性检测 留取三组研究对象2 g 粪便置于无菌容器送检,住院患者标本均取自入院后首次收集检测。用E.Z.N.A.® Stool DNA kit 试剂盒(Omega,美国)提取粪便菌群DNA。以16S rRNA 基因V3 区特异性序列为靶标进行扩增,引物序列为下游引物 5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’,上游引物5’-CGC CCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG CCTACGGGAGGCAGCAG-3’,其中CGCCCGGGGCGCG CCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG 为GC 夹。反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性30 s,54℃退火30 s,72℃延伸30 s,共30 个循环；72℃延伸5 min,4℃15 min。使用Thermocycler PCR 仪,试剂为DreamTaq Green PCR Master Mix (2x) (Thermo,美 国)。UVI 全 自动凝胶成像系统检测PCR 扩增的结果,并对产物进行DGGE。选取明显有差异的条带切胶测序(宝生物公司TaKaRa,大连,中国),所得序列在GenBank 数据库中进行基于局部比对算法的搜索工具(Blast)对比分析。

1.4 统计学方法 采用SPSS22.0 统计学软件进行数据统计分析。计量资料以均数±标准差 ()表示,采用t检验；计数资料以率(%)表示,采用χ2检验。P<0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 三组临床资料比较 T2DM 组和DKD 组收缩压、BMI 均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)；DKD组收缩压高于T2DM 组,糖尿病病程长于T2DM 组,差异有统计学意义(P<0.05)；三组舒张压比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 三组临床资料比较()

表1 三组临床资料比较()

注：与对照组比较,aP<0.05；与T2DM 组比较,bP<0.05

2.2 三组血脂指标、肾功能指标及血常规指标比较T2DM 组FPG 和TG 高于对照组,HDL-C 低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)；DKD 组NLR、UA 高于T2DM组和对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 三组血脂指标、肾功能指标及血常规指标比较()

表2 三组血脂指标、肾功能指标及血常规指标比较()

注：与对照组比较,aP<0.05；与DKD 组比较,bP<0.05

2.3 三组肠道菌群PCR-DGGE 指纹图谱分析 三组研究对象图谱间有5 条较明显的差异条带,即箭头所指的“1～5”,对照组较明显的为“1、5”,T2DM 组较明显的为“2”,DKD 组较明显的为“4”,三组研究对象均有“3”。三组研究对象图谱间条带的数目、位置、亮度均不相同,代表了三组肠道菌群指纹图谱的多样性存在差异。见图1。

图1 三组研究对象肠道菌群PCR-DGGE 指纹图谱分析

2.4 三组肠道菌群差异细菌切胶测序结果分析 三组均含有双歧杆菌属；对照组与T2DM 组差异较明显的两个条带为普雷沃氏菌属和乳杆菌属；T2DM 组与对照组和DKD 组差异较明显的细菌为真杆菌属；DKD组与T2DM 组和对照组差异较明显的细菌为普氏梭杆菌属。见表3。

表3 三组肠道菌群差异细菌切胶测序结果分析

3 讨论

本实验中,T2DM 组细菌种属和丰度明显少于对照组,优势菌群的组成也发生了变化,肠道内普雷沃氏菌属(拟杆菌门)、乳杆菌属和双歧杆菌属减少,T2DM组真杆菌属占优势,DKD 组普氏梭杆菌属占优势。糖尿病患者持续高血糖状态增加了肠道内氧化应激的水平,对肠道菌群的定植造成压力,长期服用药物破坏肠道菌群的平衡状态。肠道细菌总数减少,其释放的细胞外三磷酸腺苷(eATP)也减少,造成脂肪酸、葡萄糖等物质在细胞外堆积,促进糖尿病的发生发展。

本实验中,糖尿病肾病的发生发展与收缩压、糖尿病病程、NLR、UA 有关系,三组研究对象肠道菌群的结构和数量也存在差异,糖尿病患者肠道菌群的特异性有可能参与了DKD 的发生发展。糖尿病微血管病变引起的血流动力学改变被认为是DKD 发生的关键因素,甚至是启动因素。肠道菌群发酵膳食纤维生成的短链脂肪酸(SCFAs)目前确定有4 个G 蛋白偶联受体,其中G 蛋白偶联受体41(GPR41)和嗅觉受体78(Olfr78)位于肾脏,通过调节肾素-血管紧张素系统(RAS)参与调节血压［3］。SCFAs 中的乙酸、丙酸主要与这两种受体结合,大多由拟杆菌门发酵产生,可使实验小鼠的血压水平快速、大幅度、剂量依赖性地降低［4］。另外,肠道菌群代谢食物中富含胆碱的物质生成氧化三甲胺(TMAO),其水平与动脉粥样硬化风险呈正相关。TMAO 也是尿毒症毒素之一,与其他肠道菌群发酵蛋白质、碳水化合物等生成的有毒代谢产物一起,促进肾小球硬化和间质纤维化,加速肾功能恶化［5］。本试验中DKD 组UA 显著升高,高尿酸血症可诱发氧化应激,引起肾间质炎症,同时肠道内尿素蓄积,转化为氨及氢氧化铵使肠道pH 值增高,糖尿病患者异常的脂质代谢,使得肠道紧密连接蛋白表达减少,菌群失调又使得肠道通透性增加,细菌产生的炎性物质持续渗透到血液循环,导致内毒素血症,加速DKD 的进展。DKD患者由于控制膳食纤维摄入、长期使用药物、葡萄糖代谢受损、慢性低水平炎症状态等原因使得肠道微生态失调,肠道屏障功能破坏,肠源性脂多糖入血,尿毒症毒素积累,激活免疫系统和炎症通路,病程越长,代谢紊乱及肠道微生态失调持续时间越长,加速病程发展。

T2DM 发病机制的两个要素为胰岛素抵抗和分泌不足,胰岛素抵抗和肥胖、脂代谢异常及慢性低水平炎症反应等因素相关。食物中不能被宿主肠道消化吸收的大分子碳水化合物纤维等被肠道中细菌尤其是拟杆菌门、厚壁菌门等厌氧菌分解为SCFAs,主要包括乙酸、丙酸、丁酸等,并具有生物学效应［6］。研究发现,DKD 患者肠道菌群较健康人群存在约190 种细菌相对丰度的差异,以产SCFAs 细菌相对丰度减少为主要表现,且肠道内产丁酸酶减少,而含有形成丁酸关键酶的普雷沃菌,其相对丰度也减少［7,8］。SCFAs 可抑制炎症因子的生成；激活GPR41、G 蛋白偶联受体43(GPR43),促进结肠L 细胞释放肽YY(PYY)和胰高血糖素样肽(GLP-1),进而改善胰岛功能,降低餐后血糖、血压、改善血脂代谢异常,降低T2DM 患者体脂量［9］。目前研究证实,肠道细菌和全身慢性炎症反应紧密相关,其中真杆菌属可以引起内源性感染；乳杆菌、双歧杆菌数量的减少会使更多的内毒素脂多糖释放入血,引发代谢性内毒素血症,造成炎症和代谢紊乱,而其数量的增加则可以使糖耐量和葡萄糖诱导的胰岛素分泌水平得以改善［10］。随着DKD 进展,尿毒症毒素在患者体内逐渐积累,其中的蛋白结合毒素在肾病患者肠道中主要由梭杆菌科、肠杆菌科合成,这种可与蛋白结合的小分子毒素的增加促进了血管内皮功能障碍,直接或间接地对肾脏以及心血管系统造成了损害［11,12］。本实验中,T2DM 组的FPG、BMI 及TG 均高于对照组,HDL-C 低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。NLR 作为炎症指标,DKD 组NLR 高于T2DM 组和对照组,差异有统计学意义(P<0.05),与上述研究相符。

综上所述,糖尿病与肠道菌群失调的关系得到较多关注,肠-肾轴理论的提出进一步指出了肠道与肾脏间存在紧密联系,菌群失调与肾脏损伤互为因果。本实验是横断面研究,选取样本量有限,且DGGE 技术具有局限性,无法将肠道微生态失调与DKD 间建立明确的因果关系,但在疾病发展早期,针对不同的菌群变化特征分阶段干预,进而恢复肠道微生态稳态,是未来可以考虑的研究及治疗方向。