竹叶花椒黄酮类物质抗氧化活性及其谱效关系

何鑫柱，李潮俊，周孟焦，康 明，梁晓峰

（1. 四川中医药高等专科学校川西北中药材资源研究与开发利用实验室，四川 绵阳 621010；2．西南科技大学材料与化学学院，四川 绵阳 621010）

竹叶花椒（Zanthoxylum armatum DC.） 为芸香科花椒属植物，又名藤椒、野花椒、蜀椒和山花椒等，近年来因其对生长环境要求低、易种植、产量大等特点已经成为乡村振兴中备受关注的重要经济作物，广泛分布在四川、甘肃、陕西和云南等地区[1]。竹叶花椒传统主要用于调味品，也可用作中药，在《本草图经》中有专门记载。竹叶花椒果皮中含有黄酮类、挥发油、酰胺和生物碱等多种活性成分[2]。药理学研究表明，黄酮类物质具有较强抗氧化活性[3]，可作为天然抗氧化剂研究的原材料。竹叶花椒中黄酮类化合物成分复杂，其抗氧化活性物质基础研究还不够深入。运用谱效关系学的方法对其抗氧化活性的物质基础进行分析[4]，通过研究共有特征峰的相似度和抗氧化活性特点，构建竹叶花椒黄酮类物质化学指纹图谱和抗氧化活性之间的关系，可用于评价和预测不同来源竹叶花椒的抗氧化活性[5]。

通过建立竹叶花椒黄酮类物质的HPLC 指纹图谱，利用DPPH 法测试其抗氧化性，运用偏最小二乘回归法考查其抗氧化活性的谱效关系，为深入研究竹叶花椒黄酮类抗氧化的活性物质基础、开发天然抗氧化剂提供了试验参考。

1 材料与仪器

1.1 材料

表儿茶素、芦丁、金丝桃苷、槲皮苷、紫云英苷、异鼠李素- 3 - O -葡萄糖苷和山奈酚对照品，阿拉丁试剂（上海） 有限公司提供；甲醇、石油醚和无水乙醇，均为分析纯，成都市科隆化学品有限公司提供；过硫酸钾、DPPH（1,1 -二苯基- 2 -三硝基苯肼），国药集团化学试剂有限公司提供；聚酰胺和D101 型大孔吸附树脂，上海麦克林生化科技提供。10 批不同来源的竹叶花椒，经四川中医药高等专科学校江洪波教授鉴定为芸香科花椒属植物竹叶花椒（Zanthoxylum armatum DC.） 的果皮。

10 批次竹叶花椒来源信息见表1。

表1 10 批次竹叶花椒来源信息

1.2 仪器

UltiMate 3000 型高效液相色谱仪，美国赛默飞公司产品；752 N-Plus 型紫外可见光分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司产品；Sartorius BSA124S 型分析天平，赛多利斯科学仪器产品；RE52CS-2 型旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器产品；YTLG-12A 型冷冻干燥机，上海叶拓科技有限公司产品；XH-MC-1 型实验室微波合成仪，北京祥鹄科技产品；DHG-9075A 型电热鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器产品。

2 结果与分析

2.1 竹叶花椒黄酮的抗氧化活性测试

2.1.1 供试品溶液的制备

称取竹叶花椒果皮粉末适量，加入1∶30（g∶mL） 的60%乙醇水溶液，用微波辅助法进行提取，于80 ℃下反应25 min，提取液用石油醚进行脱脂处理[7]，再冷冻干燥得到黄酮粗提物，用聚酰胺-大孔吸附树脂对提取物进行纯化，得到淡黄色粉末状固体黄酮化合物。精密称取黄酮纯化物5.0 mg，加入乙醇溶解，用10 mL 容量瓶定容，配制成0.5 mg/mL的样品溶液，再将其分别配制质量浓度为0.005，0.010，0.020，0.040，0.080 mg/mL 的样品溶液。

2.1.2 DPPH·溶液的配制

DPPH（1,1 -二苯基- 2 -三硝基苯肼） 是一种稳定的含氮自由基。在DPPH·清除试验中，黄酮类化合物等抗氧化剂能提供氢原子与DPPH·相结合，从而导致溶液中的自由基减少，吸光度大小会发生变化，在波长517 nm 处测其吸光度变化大小来评价受试物清除DPPH·的能力。精密称取7.9 mg 的DPPH固体粉末，加入乙醇溶解，用100 mL 容量瓶定容，配成浓度为2×10-4mol/L 的DPPH·溶液。

2.1.3 DPPH·清除率的测定

利用紫外分光光度计，在波长517 nm 处测试2 mL乙醇和DPPH·混合溶液2 mL、受试物2 mL 和DPPH·混合溶液2 mL、乙醇2 mL 和受试物混合溶液2 mL 的吸光度，分别记为A0，A1和A2；测试前需在暗处反应30 min，进行3 次平行试验，清除率计算公式如下：

2.1.4 抗氧化活性测试结果

应用IBM SPSS Statistics 25 软件进行Probit 回归分析，预测出受试物的IC50。IC50表示样品清除一半自由基的溶液浓度，IC50值越小，说明受试物对自由基清除效果越好，其抗氧化能力越强。DPPH 法测定10 批次竹叶花椒黄酮抗氧化的IC50值结果。

10 批次竹叶花椒黄酮抗氧化的IC50值见表2。

表2 10 批次竹叶花椒黄酮抗氧化的IC50 值 /μg·g-1

由表2 可知，10 批次竹叶花椒黄酮清除DPPH·的能力大小为S2>S8>S3>S5>S9>S4>S6>S10>S1>S7。

2.2 竹叶花椒黄酮类物质的HPLC 指纹图谱

2.2.1 供试品溶液的制备

2.2.2 对照品溶液的配制

精密称取竹叶花椒黄酮纯化物5.0 mg，用甲醇定容至10 mL 容量瓶中，即得供试品溶液。

精密称取表儿茶素、芦丁、金丝桃苷、紫云英苷、槲皮苷、异鼠李素- 3 - O -葡萄糖苷和山奈酚7 个对照品适量，用甲醇定容至10 mL 容量瓶中，配成混合对照品溶液。

2.2.3 HPLC 测试条件

色谱柱为反相PA2 C18（50 mm×4.6 mm，3 μm）；流动相A 为0.1%甲酸水溶液，流动相B 为甲醇溶液；梯度洗脱（0~1 mim，5% B；1~3 min，5%~10% B；3~16 min，10%~90% B；16~22 min，90%B；22~22.1 min，90%~5% B；22.1~30 min，5% B）；柱温25 ℃，进样量30 μL，检测波长300 nm，流速1 mL/min。

2.2.4 精密度试验

取同一批竹叶花椒黄酮纯化物为考查对象，按2.2.1 的方法配制溶液，按2.2.3 的色谱条件重复测试一供试品溶液5 次，计算它们共有峰峰面积的标准偏差（RSD）。结果各共有色谱峰的相对峰面积的RSD 值为0.61%~2.90%，表明仪器的精密度良好。

2.2.5 稳定性试验

取同一批竹叶花椒黄酮纯化物为考查对象，按2.2.1 的方法配制溶液，按2.2.3 的色谱条件对一供试品溶液在0，4，8，12，24 h 时进行测试，计算它们共有峰峰面积的RSD。结果各共有色谱峰的相对峰面积RSD 值在0.23%~2.53%，表明样品溶液在24h内的稳定性良好。

2.2.6 重复性试验

取同一批竹叶花椒黄酮纯化物为考查对象，按2.2.1 的方法配制溶液，按2.2.3 的色谱条件对5 组平行供试品溶液进行测试，计算它们共有峰峰面积的RSD。结果各共有色谱峰的相对峰面积RSD 值在0.44%~2.43%，表明建立的HPLC 测试方法具有良好的重复性。

2.2.7 竹叶花椒黄酮HPLC 的叠加指纹图谱

将10 批次竹叶花椒黄酮的HPLC 图谱导入相似度评价软件中，对其HPLC 指纹图谱进行解析，生成一个对照指纹图谱（R） 和HPLC 共有叠加指纹图谱。

10 批次竹叶花椒黄酮样品的叠加指纹图谱见图1，混合对照品和竹叶花椒黄酮对照的指纹图谱见图2；10 批次竹叶花椒黄酮的共有峰峰面积见表3。

图1 10 批次竹叶花椒黄酮样品的叠加指纹图谱

图2 混合对照品和竹叶花椒黄酮对照的指纹图谱

表3 10 批次竹叶花椒黄酮的共有峰峰面积

由图2 可知，10 批次竹叶花椒黄酮的HPLC 指纹图谱共指认出16 个特征共有峰，其中峰5，11，12，13，14，15 和16 代表的化合物分别为表儿茶素、芦丁、金丝桃苷、紫云英苷、槲皮苷、异鼠李素- 3 - O -葡萄糖苷和山奈酚。每一个HPLC 指纹图谱中共有色谱峰的面积之和大于总面积的90%，表明该HPLC 指纹叠加图谱符合指纹图谱的评价要求，能用于竹叶花椒黄酮的谱效关系研究。

2.3 竹叶花椒黄酮抗氧化的谱效关系

采用偏最小二乘回归（PLSR） 法分析竹叶花椒黄酮的HPLC 指纹图谱共有峰峰面积与DPPH 法得到的抗氧化IC50值之间的关系。

DPPH 法的PLSR 方程的回归系数和VIP 值见图3。

图3 DPPH 法的PLSR 方程的回归系数和VIP 值

通过SPSS 软件对数据进行分析处理，得到的PLSR 方程为：

Y=0.010X1+0.002X2-0.014X3+0.084X4-0.266X2-0.121 X6+0.084X7-0.117X8-0.145X9+0.101X10+0.232 X11-0.075X12-0.150X13+0.159X14+0.072 X15-0.427X16.

16 个共有峰中的峰3，5，6，8，9，12，13 和16 对应的回归系数为负值，表明这些共有峰的峰面积越大，IC50值就越低，即清除DPPH·的能力越强。变量投影重要性值（VIP） 是PLSR 分析中一个重要的指标，VIP 值越大，表明该活性成分对药效的贡献率越大；当VIP 值> 1 时，表明该活性成分对药效呈显著相关。在DPPH 法的PLSR 分析中，VIP 值>1 的共有峰有峰1，2，4，5，6，7，9，12，13 和16，表明这些共有峰代表的化合物与竹叶花椒黄酮抗氧化活性的大小呈显著相关。结合PLSR 方程的回归系数和VIP 值，表明5，6，9，12，13 和16 对抗氧化活性的贡献值较大，这6 个共有峰代表的化合物是竹叶花椒黄酮抗氧化的主要活性物质。

3 结论

利用DPPH 法对竹叶花椒黄酮提取物的抗氧化活性进行测试，并建立了10 批次不同来源竹叶花椒黄酮的HPLC 指纹图谱，用偏最小二乘回归法分析了竹叶花椒黄酮抗氧化的谱效关系。通过相似度评价软件对10 批次竹叶花椒黄酮的HPLC 指纹图谱进行解析，得到其叠加指纹图谱，共指认出16 个共有色谱峰；峰5（表儿茶素）、6、9、12（金丝桃苷）、13（紫云英苷） 和16（山奈酚） 这6 个共有峰所代表的化合物是竹叶花椒黄酮抗氧化的主要活性成分。