响应面法优化克氏鳌虾壳蛋白质酶解工艺研究

郭梦玲，陈 旭

（武汉设计工程学院食品与生物科技学院，湖北 武汉 430205）

0 引言

克氏原螯虾（Polcambarus clarkii)，又名美国螯虾，在中国大陆被称为“小龙虾”，是我国最有营养的一种淡水龙虾，年产量为整个龙虾产量的70%~80%。小龙虾产业在江苏、湖北、江西、安徽、湖南等地被打造为地方特色产业[1]，龙虾具有较强的生命力和快速的繁殖能力，易于饲养。虾肉具有高蛋白、低脂肪、氨基酸种类齐全、虾青素天然色素、矿物质元素含量高等营养特性[2]，含20%蛋白质，是鱼、蛋、奶的数倍，虾的氨基酸含量比鱼、蛋、奶要高出10 多倍，而虾壳中的氨基酸虽然含量不多，但也是一种很好的补充，而且，虾中的甘氨酸含量也比较高[3-4]。

虾头和虾壳占虾质量的85%左右，每年全国的龙虾加工废弃物达7 万t，造成了巨大的资源浪费和环境污染，其中残留有大量的蛋白质，另外还有不饱和脂肪酸、虾青素、游离氨基酸和微量元素，且含有丰富的硒、维C、维E 等成分，营养价值很高，可用来制备甲壳素、提取蛋白肽、萃取虾青素、制备壳聚糖、加工鱼类饲料等[5-7]。在虾、蟹加工过程中，会产生30%~40%的加工副产物，若不能加以合理利用，会对生态环境造成一定污染，同时也会增加企业的负担[8-9]。相关研究表明，虾壳和虾头还可被直接用于工业生产，也可用作香料原料，近年来发展迅速，用途广泛。近年来，随着国内虾、蟹养殖的不断发展，此类固体废物的数量不断增加，如果不加以妥善处置，将会产生腐烂的恶臭，对环境产生严重的影响。通过对这些固体垃圾进行综合处理，再将这些垃圾中的各种物质变成有用的物质，是一种可以变废为宝的方法[10]。废物的再利用是当今社会和经济发展的重要问题，也是现代科技面临的新问题[11]。

近年来，国内外学者对各种水产品废弃物中的蛋白质进行了大量的研究，但其综合利用的状况并不理想，目前尚无科学、合理的处理办法，加上利用的费用太高、投资不足、资源浪费严重等问题尚未从根本上改变，如何科学、经济地利用已成为亟待解决的问题。

龙虾废弃物中蛋白质的提取方法包括碱提取法、酸提取法、水洗提取法、盐提取法、有机溶剂提取法、超声波辅助提取法和酶解法等[12-13]。酶解法是一种新型的蛋白质提取技术，其原理是在特定的温度、特定的环境下，蛋白酶具有特定的催化位点，能促进蛋白质的胶合反应，使其分解为低分子量的多肽，从而降低其溶解度，实现蛋白质的萃取[14]。酶解萃取工艺条件温和、蛋白稳定性好，可用于各种动物、植物、微生物等植物蛋白的提取[15]。

通过单因素试验和响应面试验，探讨了酶解时间、酶添加量、pH 值、温度、料液比等对虾壳蛋白的影响。对提高水产品附加值，降低产品成本，以及经济、生态和社会效益具有重要的作用。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 试验材料

硼酸、甲基红指示剂、95%乙醇、溴甲酚绿指示剂、盐酸、氢氧化钠、磷酸、硫酸、硫酸铜、牛血清蛋白、硫酸钾、三氯乙酸，天津市凯通化学试剂有限公司提供；碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶提供广州赛国生物有限公司提供；龙虾壳粉，市售。

1.1.2 试验设备

HH-6 型数显恒温水浴锅，常州金坛良友仪器有限公司产品；UV-759CRT 型紫外可见分光光度计，青岛聚创环保集团有限公司产品；YP5002 型电子天平，上海佑科仪器仪表有限公司产品；KH20R-ll 型高速离心机，湖南凯达科学仪器有限公司产品；DF-04C 型消化炉，东方鑫鸿科技有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 克氏鳌虾壳蛋白肽制备工艺流程

虾壳粉→酶解→灭酶→TCA 处理→取上清液→测定蛋白质含量→计算水解度。

1.2.2 龙虾壳粉中蛋白质的含量测定

称取0.5 g 龙虾壳粉移入干燥的消化管中，加入浓硫酸、硫酸铜、硫酸钾，将其放入消化炉中消化。向水蒸气发生器中装入蒸馏水2/3 处，加入玻璃珠、甲基红指示剂、硫酸，以保存水呈酸性，加热煮沸水蒸气发生器的水并保持沸腾。用硼酸进行吸收，用标准盐酸溶液滴定。计算样品蛋白质含量[16]。

式中：X——样品中蛋白质含量，g/100 g；

V1——试液消耗盐酸的体积，mL；

V2——试剂空白消耗盐酸的体积，mL；

V3——吸取消化液的体积，mL；

C——盐酸标准溶液的浓度，mol/L；

0.014 ——盐酸标准滴定液相当的氮的质量，g；

m——样品的质量，g；

F——氮换算系数为蛋白质的系数。一般食物为6.25。

1.2.3 蛋白质水解度的测定

取10 mL 上清液于离心管中，加入等量的15%TCA溶液，混匀，室温下静置30 min，以转速5 000 r/min离心15 min，取全部上清液测其蛋白质含量，计算水解度。

1.2.4 克氏鳌虾虾壳蛋白肽制备单因素试验

（1） 不同蛋白酶对克氏螯虾虾壳蛋白质水解度的影响。称取5 g 虾壳粉，分别选取木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶进行试验，调节体系分别维持在各蛋白酶的最适pH 值、最适酶解温度，料液比均为1∶10，酶添加量为虾壳粉蛋白质含量的2%，酶解3 h 后沸水浴灭酶10 min，以转速4 000 r/min 离心10 min，测定上清液中的蛋白质含量，计算水解度，确定适宜的酶[17]。

（2） pH 值对克氏螯虾虾壳蛋白质水解度的影响。在酶解时间为3 h，酶解温度为55 ℃，酶添加量为2.5%，料液比为1∶10 的条件下，分别设置体系pH 值为7.5，8.0，8.5，9.0，测定上清液中蛋白质含量，计算水解度，确定适宜pH 值。

（3） 料液比对克氏螯虾虾壳蛋白质水解度的影响。在酶解时间为3 h，酶解温度为55 ℃，酶添加量为2.5%，pH 值为8.5 的条件下，分别设置料液比为1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，测定上清液中蛋白质含量，计算水解度，确定适宜料液比。

（4） 酶添加量对克氏螯虾虾壳蛋白质水解度的影响。在酶解时间为3 h，酶解温度为55 ℃，pH 值为8.5，料液比为1∶10，的条件下，分别设置酶添加量2.0%，2.5%，3.0%，3.5%，测定上清液中蛋白质含量，计算水解度，确定适宜酶添加量。

（5） 酶解时间对克氏螯虾虾壳蛋白质水解度的影响。在酶解温度为55 ℃，pH 值为8.5，酶添加量为2.5%，料液比为1∶10 的条件下，分别酶解1，2，3，4，5 h，测定上清液中蛋白质含量，计算水解度，确定适宜酶解时间。

（6） 酶解温度对克氏螯虾虾壳蛋白质水解度的影响。在酶解时间为3 h，pH 值为8.5，酶添加量为2.5%，料液比为1∶10 的条件下，分别设置酶解温度为45，50，55，60 ℃，测定上清液中蛋白质含量，计算水解度，确定适宜酶解温度。

1.2.5 响应面试验设计

通过Design Expert 软件Box-behnken 中心组合试验设计，分析酶添加量（A）、pH 值（B）、料液比（C） 3 个因素之间的相互作用对蛋白酶水解度（Y）所产生的影响。

响应面分析试验因素与水平设计见表1。

表1 响应面分析试验因素与水平设计

2 结果与分析

2.1 蛋白质的标准曲线

将蛋白质含量（X） 作为横坐标，吸光度（Y）作为纵坐标进行线性回归，得出了Y=7.1X+0.012 4，R2=0.996 3 的回归方程，线性关系良好。

蛋白质含量标准曲线见图1。

图1 蛋白质含量标准曲线

2.2 不同蛋白酶对克氏螯虾虾壳蛋白质水解度的影响

不同蛋白酶对克氏螯虾虾壳蛋白质水解度的影响见图2。

图2 不同蛋白酶对克氏螯虾虾壳蛋白质水解度的影响

由图2 可知，4 种酶水解蛋白的作用强弱依次为碱性蛋白酶>中性蛋白酶>木瓜蛋白酶>风味蛋白酶，其中以风味蛋白酶水解虾壳蛋白的作用最小，碱性蛋白酶水解虾壳蛋白效果为最佳，其水解率可达48.2%。其原因是碱性蛋白酶的耐热性和水解性能好，且对虾壳蛋白有很好的溶解作用，因而水解效果最佳。因此，为了更好地水解蛋白质，故选取碱性蛋白酶为酶解蛋白酶。

2.3 pH 值对克氏螯虾虾壳蛋白质水解度的影响

pH 值对克氏螯虾虾壳蛋白质水解度的影响见图3。

图3 pH 值对克氏螯虾虾壳蛋白质水解度的影响

由图3 可知，pH 值为8.5 时最高，此时蛋白质水解度为51.4%，表明该酶的最佳pH 值为8.5，如果pH 值太高或太低，会使蛋白酶变性失活，则会对底物和酶的结合产生不利的作用，进而影响酶解的效率，导致蛋白质水解度明显降低。因此，pH 值为8~9 较适宜。

2.4 料液比对克氏螯虾虾壳蛋白质水解度的影响

不同料液比下的蛋白质水解度见图4。

图4 不同料液比下的蛋白质水解度

由图4 可知，在其他条件相同的情况下，蛋白质的水解度随溶剂的增大而先上升再下降，在料液比为1∶20（g∶mL） 时，蛋白质的水解度最大值为64.1%，随后水解度下降。这可能是由于反应物被稀释，从而降低了碱性蛋白酶和蛋白质的结合，导致蛋白质水解度降低，故选取最优料液比范围为1∶15~1∶25。

2.5 酶添加量对克氏螯虾虾壳蛋白质水解度的影响

不同酶添加量的蛋白质水解度见图5。

图5 不同加酶量的蛋白质水解度

由图5 可知，水解蛋白的水解度随酶添加量的增大而先上升后降低，最大酶添加量为3%，水解度为59.8%。原因可能是酶的浓度越高，酶与基质的结合越趋于饱和，结合位点越多，水解度达到最大，若继续增加酶的浓度，由于底物浓度固定，对其水解度不会有太大的影响，所以选择的最佳酶添加量为2.5%~3.5%。

2.6 酶解时间对克氏螯虾虾壳蛋白质水解度的影响

不同酶解时间下的蛋白质水解度见图6。

图6 不同酶解时间下的蛋白质水解度

由图6 可知，1~3 h 的水解效果明显提高，3 h后，水解效果降低，4~5 h 后，水解度趋于平稳。试验表明，在酶解前期，随着酶解时间的延长，蛋白和酶的反应会更加充分，蛋白质水解度逐渐增加，3 h时，蛋白质的水解度最高，达46.4%。3 h 后，酶与蛋白反应充分，其催化活性降低，水解性降低，因而最佳酶解时间为3 h。

2.7 酶解温度对克氏螯虾虾壳蛋白质水解度的影响

酶解温度对蛋白质水解度的影响见图7。

图7 酶解温度对蛋白质水解度的影响

由图7 可知，酶解温度在45~55 ℃时水解度升高，于55~65 ℃下水解度下降，55 ℃达到最高值，蛋白质水解度为47.6%；这主要是因为不同的酶具有最佳的反应温度，在特定的温度下，酶的活性分子含量会达到最高，从而加快酶与蛋白的反应速度，而酶本身就是蛋白质，如果温度太高，酶就会失活或变性，从而导致其水解度降低。

2.8 响应面优化试验结果分析

2.8.1 Box-behnken 试验回归模型的建立及方差分析

以蛋白质水解度评价指标的响应值，选择酶添加量（A），pH 值（B），料液比（C） 进行Box-behnken试验的优化设计，获取最佳酶解工艺条件。

响应面设计方案及结果见表2，回归模型的方差分析及显著性检验见表3，回归方程的可信度分析见表4。

表2 响应面设计方案及结果

表3 回归模型的方差分析及显著性检验

表4 回归方程的可信度分析

利用Desig Experpt 11 对表2 ~表9 的试验数据进行回归拟合，得到二次多项回归方程：

Y=55.28+0.562 5A+0.775 0B-1.56C-0.200 0AB-1.58AC+0.600 0BC+0.922 5A2-2.25B2-1.63C2.

p<0.000 1，表明模型非常明显；而p>0.05，表明模型则相对稳定。C.V%<10%，说明其可信度较高[16]。一次项B 项、C 项、交互项AC、二次项B2、C2对蛋白水解的影响最大，而A 项，交互项BC 和二项A2项对蛋白水解的影响较大，而交互项AB 项对蛋白水解的影响不大，R2Adj=0.962，R2=0.983，两者之间具有较好的相关性，且具有较好的拟合性和较低的试验误差。

2.8.2 响应面试验中交互项作用分析

酶添加量与pH 值影响蛋白质水解效果的等高线图和响应面图见图8，酶添加量与料液比影响蛋白质水解效果的的等高线图和响应面图见图9，料液比与pH 值影响蛋白质水解效果的等高线图和响应面图见图10。

图8 酶添加量与pH 值影响蛋白质水解效果的等高线图和响应面图

图9 酶添加量与料液比影响蛋白质水解效果的等高线图和响应面图

图10 料液比与pH 值影响蛋白质水解效果的等高线图和响应面图

由图8 可知，在酶添加量一定时，蛋白质水解度随pH 值先增大然后减小，响应面坡度稍陡峭；pH 值一定时，蛋白质水解度随酶添加量的增加无较大的变化，响应面坡度较小；pH 值和酶添加量的相互作用不明显。

由图9 可知，在酶添加量一定时，蛋白质水解度随料液比先增大然后减小，响应面坡度稍陡峭；在一定的料液比范围内，蛋白质水解度随酶添加量的增加无较大的变化，响应面坡度较小；pH 值和酶添加量的相互作用不显著。

由图10 可知，在料液比一定时，蛋白质水解度随pH 值先增大然后减小，响应面坡度稍陡峭；在一定的pH 值内，蛋白质水解度随料液比的增大无较大的变化，响应面坡度稍陡峭；pH 值和料液比的相互作用较明显。

2.8.3 提取工艺优化

通过Box-behnken 模型优化得到虾壳蛋白酶解的最佳工艺条件为pH 值8.58，酶添加量3.06%，料液比1∶22，相应蛋白质水解度的预测值为55.8%。为了验证响应面试验结果，且便于具体操作，把酶解条件调整为pH 值8.5，酶添加量3%，料液比1∶20。3 次平行试验得到蛋白质水解度的平均值为54.2%，试验结果与理论预测值相近，具有一定的实际应用价值。

3 结论

通过响应面试验对克氏螯虾虾壳酶解工艺进行了优化，结果表明，pH 值8.5，酶添加量3%，料液比1∶20 时酶解效果最好，蛋白质水解为54.2%。对克氏螯虾壳的综合利用提供了一定的理论依据。