双水相-超高效液相色谱串联质谱法测定猪肉中17种抗生素

李雨薇，张洪昌，胡双庆，李贞金，沈根祥，赵晓祥

(1.东华大学 环境科学与工程学院, 上海 201620;2.上海市环境科学研究院 国家环境保护新型污染物环境健康影响评价重点实验室, 上海 200233)

长期以来,抗生素被广泛应用于畜禽养殖业[1],用于防治病害、提高饲料利用率和促进动物生长等。据统计[2],2013年我国兽用抗生素的使用量约84 200 t。然而,随着畜禽疾病的复杂化,抗生素的滥用率也逐渐提高[3]。滥用抗生素会使其在动物体内积累,从而造成动物源性食品中抗生素的残留,甚至通过食物链进入人体。前人已在猪肉、猪肝、鸡蛋和牛奶中检测到不同浓度的抗生素残留[4-9],Wang等[10-11]在江浙沪幼童尿液中检出兽用抗生素,而动物源性食品是最可能的来源。残留的抗生素通过食物链进入人体,会造成人体胃肠菌群失调,引起长期腹泻等反应[12-13],严重的会造成免疫系统功能受损,甚至致畸、致癌[14-16]。

近几年来,抗生素药物残留的检测技术层出不穷[17-21]。目前,残留抗生素检测的前处理方法主要有液-液萃取、超声溶剂萃取、固相萃取、加压液体萃取、微波萃取等,检测方法主要有电化学检测法[22]、液相色谱法和液质联用法等[23-25]。这些方法虽能获得较好的回收率,但仍存在效率低、耗材昂贵等问题。猪肉中抗生素含量极低,且样品基质复杂,基质干扰较为严重[26-27],这是分析中的一大难点。虽然有学者采用超声波溶剂萃取作为前处理方法[28],但是现行国标方法中的前处理方式大多为固相萃取,存在耗时长、成本高、溶剂浪费严重等缺点。新兴的双水相萃取技术已被广泛用于提取和分配多种分析物,如蛋白质、DNA、纳米粒子、染料、金属和新兴污染物等[29-33],集富集、净化于一体,萃取条件温和,减少了有机溶剂残留[31],与传统的萃取方式相比,双水相萃取技术在保证萃取效率的同时可节约时间成本和物质成本[34]。目前双水相方法针对有机污染物的提取报道多应用于液体基质(水样),而在肌肉组织中应用该方法的报道较少。

前期调研了畜禽养殖中的常用抗生素,发现四环素类、磺胺类、大环内酯类、喹诺酮类以及头孢类用量较大,且这些抗生素不仅在肉类产品中被检出[8-9,35-36],还在猪粪尿以及其他环境基质中的检出量大[21,37-38],故选取这5类17种抗生素作为研究对象。采用双水相萃取技术结合超高效液相色谱串联质谱仪建立一种同时测定猪肉中17种典型抗生素的分析方法,对市售猪肉中抗生素残留进行检测,以期为未来研究多种类抗生素的联合检测方法提供一定的借鉴。

1 材料与方法

1.1 样品的采集与处理

选取上海市市售猪肉作为研究对象,采集猪肉样品去皮切块,按猪肉与超纯水的质量比为4∶1在玻璃瓶内匀浆,匀浆好的猪肉4 ℃冷藏待用。

1.2 仪器与试剂

Waters Xevo TQ-XS型超高效液相色谱串联质谱仪,美国 Waters公司;AUTO-EVA型全自动氮吹仪,厦门睿科有限公司;Fotector Plus型全自动固相萃取仪,厦门睿科有限公司;Milli-Q型超纯水仪,美国Millipore公司;AUW220 D型电子分析天平,上海岛津实验器材有限公司;Oasis HLB型固相萃取小柱(500 mg,6 mL),美国Waters公司;F6/10 Tissuelyser型匀浆机,上海净信实业发展有限公司。

17种抗生素标准品,包括:4种大环内酯类,即替米考星(Tilmicosin,TIL)、泰乐菌素(Tylosin,TYL)、克拉霉素(Clarithromycin,CLR)、阿奇霉素(Azithromycin,AZI);5种喹诺酮类,即恩诺沙星(Enrofloxacin,ENR)、环丙沙星(Ciprofloxacin,CIP)、沙拉沙星(Sarafloxacin,SAR)、达诺沙星(Danofloxacin,DAN)、诺氟沙星(Norfloxacin,NOR);4种四环素类,即土霉素(Oxytetracycline,OTC)、金霉素(Chlortetracycline,CTC)、强力霉素(Doxycycline,DOX)、四环素(Tetracycline,TC);3种磺胺类,即磺胺二甲嘧啶(Sulfamethazine,SM2)、磺胺间甲氧嘧啶(Sulfamonomethoxine,SMM)、磺胺嘧啶(Sulfadiazine,SD);1种头孢类,即头孢噻呋(Ceftiofur,CEF)。所有抗生素的纯度均大于95%,购自德国Dr. Ehrenstorfer公司。用于定量的内标物:四环素-D6(Tetracycline-D6,TC-D6)和磺胺甲恶唑-D4(Sulfamethoxazole-D4,SMX-D4)购自德国Dr. Ehrenstorfer公司,氧氟沙星-D3(Ofloxacin-D3,OFL-D3)购自德国Witega公司,头孢噻呋-D3(Ceftiofur-D3,CEF-D3)购自英国Cambridge Isotope Laboratories公司。甲醇、乙腈、正己烷和甲酸均为色谱级,购自德国Merck公司。乙二胺四乙酸二钠(Na2-EDTA)、磷酸氢二钠、柠檬酸、硫酸铵、磷酸氢二钾均为分析纯,购自上海睿捷化学试剂有限公司。

标准溶液的配制。分别准确称取10 mg抗生素及其内标物标准品,采用甲醇溶解并定容到100 mL,得到终质量浓度为100 mg/L的抗生素混合标准溶液于-20 ℃冰箱中避光冷藏保存。

EDTA-Mcllvaine缓冲溶液的配制。准确称取37.2 g Na2-EDTA、27.5 g磷酸氢二钠和12.9 g柠檬酸,采用超纯水定容至1 L,使用前配制。

Na2-EDTA溶液配制。准确称取3.7 gNa2-EDTA,采用超纯水定容至100 mL,使用前配制。

1.3 样品前处理

加标样品配制。精准称取1 g脱脂匀浆猪肉于离心管中,添加不同质量浓度的抗生素混合标准溶液,以及10 μL质量浓度为10 mg/L的氧氟沙星-D3、四环素-D6、磺胺甲恶唑-D4和头孢噻呋-D3内标物质,涡旋30 s,通风橱中放置10 min。

采用的超声波溶剂提取参照文献[17],固相萃取参照国家标准[20]。

超声波溶剂提取。在加标样品中加入10 mL乙腈,超声10 min,涡旋5 min,以8 000 r/min的转速离心3 min,离心半径为6.5 cm,将上清液转移至另一离心管中,向残渣中加入10 mL乙腈重复提取。合并上清液,加入2 g氯化钠和20 mL正己烷,涡旋2 min,以8 000 r/min的转速离心3 min,离心半径为6.5 cm,取乙腈层溶液,于40 ℃氮气吹干,用1 mL体积比为1∶9的0.1%甲酸/甲醇溶解残渣,过0.22 μm聚四氟乙烯针式滤器至棕色小瓶中待测。

固相萃取。在加标样品中加入10 mL浓度为0.1 mol/L EDTA-Mcllvaine缓冲溶液,涡旋3 min,以10 000 r/min的转速离心5 min,离心半径为6.5 cm,提取两次后合并上清液,经Oasis HLB固相萃取小柱,用6 mL甲醇、6 mL水活化,再用6 mL水、6 mL 5%甲醇水淋洗,最后用10 mL甲醇洗脱。洗脱液氮气吹干,用1 mL体积比为1∶9的0.1%甲酸/甲醇溶解残渣,过0.22 μm聚四氟乙烯针式滤器至棕色小瓶中待测。

双水相萃取。在加标样品中加入0.2%甲酸-乙腈和Na2-EDTA体积比为7∶3的混合溶液10 mL,涡旋混合1 min,通风橱中静置45 min;加入1.5 g硫酸铵,涡旋混合2 min,通风橱中静置3 h使溶液分层形成双水相。取上层以乙腈为主的有机液5 mL于40 ℃氮气吹干,用1 mL 70%甲醇水溶解残渣,过0.22 μm聚四氟乙烯针式滤器至棕色小瓶中待测。

以上每组试验设置3个平行试验,且以不添加抗生素的样品组作为空白样品组。

1.4 仪器条件的优化

1.4.1 质谱条件

离子源为电喷雾离子源(electrospray ionization,ESI),扫描方式为正离子扫描,检测方式为多反应监测(multiple reaction monitoring,MRM),碰撞气体为高纯氩气,脱溶剂气流温度为500 ℃,脱溶剂气流速度为1 000 L/h,毛细管电压为3.5 kV,扫描时间为0.1 s。优化后的质谱分析参数如表1所示。

表1 17种抗生素的质谱检测条件

1.4.2 色谱条件

Waters BEH C18型色谱柱(2.1 mm×50 mm,1.7 μm),柱温为35 ℃,进样体积为1.5 μL,流动相A为0.5%甲酸-水溶液,流动相B为乙腈,流速为0.35 mL/min。梯度洗脱程序:0～1 min时,A相和B相体积比为92∶8;1.0～1.2 min时,A相和B相体积比为92∶8～80∶20;1.2～2.5 min时,A相和B相体积比为80∶20;2.5～2.7 min时,A相和B相体积比为80∶20～3∶97;2.7～4.5 min,A相和B相体积比为3∶97;4.5～4.7 min时,A相和B相体积比为3∶97～92∶8;4.7～7.5 min时,A相和B相体积比为92∶8。17种抗生素和4种内标物优化后的总离子流图如图1所示。

1.5 方法评价

采用内标法定量,混合标准溶液用色谱级甲醇稀释,配制成质量浓度为1.37、3.14、12.35、37.04、111.11、333.33、500.00 μg/L的抗生素标准工作溶液,分别加入10 μL质量浓度为10 mg/L的氧氟沙星-D3、四环素-D6、磺胺甲恶唑-D4和头孢噻呋-D3内标混合溶液并充分混合,使内标终质量浓度为100 μg/L,得到各目标抗生素的标准曲线。采用加标回收法计算加标回收率和相对标准偏差,以验证方法有效性。采用信噪比法(S/N)确定仪器检测限(limit of detection,LOD)和仪器定量限(limit of quantification,LOQ)。以3倍信噪比估算出仪器检测限,10倍信噪比估算出仪器定量限。方法检出限(method detection limit,MDL)的计算式为

DL=T(n-1,α=0.01)×S

式中:DL为方法检出限;T(n-1,α=0.01)表示自由度为n-1和置信度为99%时的T分布;n为样品的平行测定数,n=7;S为n次平行测定的标准偏差。

2 结果与讨论

2.1 仪器检出限、定量限和方法检出限

将质量浓度为1.37～500.00 μg/L的抗生素标准工作溶液在第1.4节的条件下进行检测,以目标物质量浓度为横坐标、质谱定量峰面积为纵坐标绘制标准曲线,得出在试验条件下所有抗生素的质量浓度与质谱峰面积的线性关系良好,相关系数均大于0.994 4,仪器检出限为0.04～5.51 μg/L,仪器定量限为0.14～18.35 μg/L,方法检出限为2.38～7.85 μg/kg,具体结果如表2所示。该方法条件下四环素类抗生素方法检出限为3.08～6.48 μg/kg,与王飞等[39]报道的四环素类检出限为5.00 μg/kg相比,OTC和CTC的检出限有所降低。

注:纵坐标标目为相对丰度/%。图1 17种抗生素及4种内标物的总离子流图Fig.1 Total ion chromatogram of 17 antibiotics and 4 internal standards

表2 17种抗生素的保留时间、回归曲线方程、相关系数、仪器检出限、定量限和方法检出限

2.2 前处理方法的优化

2.2.1 提取方法的选择

以回收率考察3种前处理方法的提取效果,不同提取方式对17种抗生素的加标回收率如图2所示。

图2 不同提取方式对17种抗生素的加标回收率Fig.2 The spiked recoveries of 17 antibiotics by different extraction methods

超声波溶剂提取法:4种大环内酯类抗生素的回收率均在56.2%以下,可能该类物质提取过程中损失较多;5种喹诺酮类抗生素的回收率为66.6%～165.4%,其中环丙沙星(162.0%)和诺氟沙星(165.4%)回收率较高,可能是基质干扰的原因;其余8种抗生素的回收率为77.7%～131.4%,回收率在正常范围内。固相萃取法:4种大环内酯类抗生素的回收率均低于35.0%,这可能由于该类固相萃取条件没有优化完善或繁琐的过程造成了该抗生素的损失;5种喹诺酮类抗生素中沙拉沙星的回收率为119.3%,其余抗生素回收率为140.9%～292.3%,具体原因需要做进一步探究;其余8种抗生素的回收率为65.3%～129.7%。以上两种提取方式对大环内酯类抗生素的提取效果较差,且难以消除基质对喹诺酮类抗生素的影响(回收率大多为150.0%～300.0%)。双水相萃取的原理主要是利用物质在两相间的选择性分配差异而进行的分离提纯,使得大部分溶于水的杂质保留在下层水相,而对乙腈亲和度较高的抗生素被保留在上层有机相。采用双水相提取不仅提高了大环内酯的回收率(66.3%～89.4%),还有效降低了基质对喹诺酮类抗生素(回收率为72.4%～106.1%)的干扰。综合考虑各抗生素的回收率水平,选择双水相萃取作为前处理方法。

2.2.2 双水相萃取条件的优化

乙腈能促进蛋白质沉淀,其比甲醇和乙酸乙酯更易去除基质干扰。文献[28]研究显示,乙腈体积分数小于60%不能引起蛋白质完全变性,而纯乙腈易使蛋白质快速变性凝聚后包裹药物,导致药物回收率偏低。故选择体积分数为70%～90%的乙腈水溶液进行试验,发现体积分数为70%的乙腈水溶液的萃取效果最佳。试验中还发现在乙腈水溶液中添加体积分数为0.2%甲酸能显著提高抗生素回收率,这与Song等[24]研究结果一致。文献[40-43]的研究表明,EDTA可以提高四环素类、喹诺酮类和大环内酯类抗生素的萃取效率,Na2-EDTA具有相同作用,且更易配制,故采用Na2-EDTA作为螯合剂。选择2种不同组成的提取液分别为体积比为7∶3的0.2%甲酸-乙腈/水和体积比为7∶3的0.2%甲酸-乙腈/Na2-EDTA,不同提取溶液对17种抗生素的加标回收率如图3所示。

图3 不同提取溶液对17种抗生素的加标回收率Fig.3 The spiked recoveries of 17 antibiotics by different extraction solutions

选用体积比为7∶3的0.2%甲酸-乙腈/水时:大环内酯类抗生素的回收率为127.0%～164.4%,头孢噻呋的回收率为160.3%,两者回收率偏高的原因可能是基质效应;喹诺酮类抗生素回收率为79.2%～108.5%;磺胺类抗生素的回收率为92.3%～101.7%;而四环素类抗生素回收率偏低为49.6%～55.6%,这可能是由于试验中接触到的金属离子与四环素类药物相互作用所致的[39]。选用体积比为7∶3的0.2%甲酸-乙腈/Na2-EDTA时:磺胺类抗生素的回收率为94.9%～100.0%;头孢噻呋的回收率降低为129.7%;四环素类抗生素的回收率为65.3%～106.1%,有显著提高,与王飞等[39]报道的四环素类回收率为53.4%～89.4%相比也有所提高;大环内酯类和喹诺酮类抗生素的回收率有所降低,分别为114.4%～124.7%和72.4%～106.1%,这与Freitas等[40]报道的EDTA能提高喹诺酮类和大环内酯类萃取效果不一致,造成这种结果的原因可能是样品基质不同,具体原因需进一步探究。

在选择分相盐时发现K2HPO4和(NH4)2SO4的回收率不存在显著性差异,但选用(NH4)2SO4时,双水相成相时间短且上层提取液较为澄清。多次筛选重复试验发现,当样品质量为1.0 g、提取液为10 mL时,加入1.5 g (NH4)2SO4,双水相成相速度快且萃取效果佳。综上所述,考虑全部目标抗生素的回收率,最终确定体积比为7∶3的0.2%甲酸-乙腈/Na2-EDTA为最佳提取溶液,(NH4)2SO4为最佳分相盐。

2.3 萃取方法评价

采用优化后的检测方法,在不同的加标水平进行加标回收试验,最终计算得到各抗生素的平均回收率结果如表3所示。各目标抗生素在4个加标水平(10.0、50.0、100.0、200.0 μg/kg)下的回收率良好,相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)均小于12.6%。

表3 不同加标水平的17种抗生素加标回收率及相对标准偏差Table 3 The spiked recoveries and relative standard deviations of 17 antibiotics at different spiked levels

2.4 实际样品检测结果

应用本文方法对上海地区市售猪肉样品进行检测,17种抗生素均未检出,与Chen等[9]报道在25个猪肉、猪肝、牛奶样品中检出SAR、ENR和TC的质量浓度为5.10～22.30 μg/kg,两者的检出结果稍有差异,这种不一致可能与研究区域生产和使用抗生素的种类不同有关。这表明不同地区、不同来源的猪肉样品所检出抗生素的种类和检出水平有所差异,其主要受养殖末期抗生素使用情况的影响。本文试验猪肉样品所有检测结果均符合食品安全国家标准[43]规定,没有检出抗生素含量超标的猪肉。

3 结 论

(1)双水相萃取结合超高效液相色谱串联质谱法能有效提取猪肉中的17种目标抗生素,选用体积比为7∶3的0.2%甲酸-乙腈/Na2-EDTA作为萃取溶剂,(NH4)2SO4作为分相盐时,17种目标抗生素的回收率最佳。

(2)通过与其他传统前处理方法对比,本文方法集富集、净化于一体,耗时短、效率高,17种抗生素的回收率为65.3%～129.7%,相对标准偏差小于12.6%,符合残留检测要求。

(3)实际猪肉样品均未检出17种抗生素,但鉴于畜禽养殖过程中存在抗生素违规使用的风险,应进一步加强对畜禽养殖业抗生素使用的监管。