具有分子伴侣功能的抗体*

林景也 李 森

（1）北京师范大学生命科学学院，北京 100875；2）北京师范大学，生命科学与技术国家级实验教学示范中心，北京 100875）

在生物体中，即使是结构最复杂的大分子在正常情况下也能精确、保真地进行自组装，蛋白质自发折叠成紧凑的三维结构是其中最普遍的例子。蛋白质折叠对于生命活动具有重大意义，除了产生正常的生物活性外，其还与许多生物进程密切相关，包括将分子运输到特定的细胞位置以及调节细胞的生长与分化等［1］。毫无疑问，只有正确折叠的蛋白质才能在拥挤的生物环境中具有长期稳定性并承担正常的生理功能。蛋白质无法正确折叠或者无法维持正确折叠的结构是多种病理状况的根源［2］。体外及体内的多肽链在某些情况下会产生缺乏生物学活性的错误折叠构象，蛋白质的错误折叠常常伴随着蛋白质的异常聚集。这不仅给蛋白质的工业化生产带来了困难，也是体内蛋白质错误折叠相关疾病的根源。

在蛋白质的折叠过程中，分子伴侣发挥了重要作用，一些分子伴侣与新生肽链相互作用，另一些分子伴侣则会参与蛋白质折叠过程的后期阶段，增强蛋白质的稳定性［3-4］。天然的分子伴侣通常是多功能的，具有非特异性。而近年来的研究发现，一些抗体也具有分子伴侣功能，这无疑是令人惊喜的，因为抗体天然具备了对靶蛋白的高亲和力及高特异性的优点。对这一类抗体的研制和应用将有助于在工业生产中提高包涵体等蛋白质产品的复性效率，也有利于研发用于治疗蛋白质错误折叠疾病的生物药物。本文主要介绍了具有分子伴侣功能的抗体的发现、研究进展及具体应用。

1 分子伴侣的发现、概念与基本功能

分子伴侣（molecular chaperone） 一词源于1978 年，Laskey 等［5］首次在体外实验中发现一种核内酸性蛋白（nucleoplasmin）是组蛋白和DNA组装成核小体的必需物质，他们将这种蛋白质命名为“molecular chaperone”。后来Ellis 等［6］在研究高等植物叶绿体中的核酮糖1,5-二磷酸羧化/加氧酶（Rubisco）时也发现了类似现象，在叶绿体中合成的8 个大亚基与在细胞质中合成的8 个小亚基必须先和一种蛋白质结合后，才能在叶绿体内组装成活性酶分子。1987 年Ellis［7］正式提出了“molecular chaperone”的概念，经几度修正，1993 年Ellis［8］给了“分子伴侣”更确切的定义：即一大类相互之间没有关系的蛋白质，它们具有的共同功能是帮助其他含多肽类结构的物质在体内进行正确的非共价组装，但不是这些物质在发挥其正常的生物学功能时的永久组成成分。分子伴侣广泛存在于各类细胞和亚细胞结构当中，并参与多个细胞进程，包括帮助蛋白质从头折叠、防止错误折叠的蛋白质聚集、参与寡聚蛋白质的组装、变性蛋白质的重折叠、细胞内蛋白质的运输以及协助蛋白质的水解［9］。

分子伴侣目前已被发现具有很多重要的生理功能与实用价值。首先，其可用于预防和治疗蛋白质错误折叠相关疾病，一方面通过帮助蛋白质正确折叠、防止错误折叠和聚集，从根本上降低蛋白质错误折叠相关疾病的发病可能，另一方面结合新生肽链并稳定其构象，帮助蛋白质的转运，避免因蛋白质无法正确转运而导致折叠病的发生。其次，分子伴侣是一类具有重要生理意义的分子，参与生物机体的应激反应、遗传物质的复制转录、生物信号转导、细胞周期与凋亡的调控、肿瘤细胞的增殖等过程。此外，在工业与医药业生产中，分子伴侣可用于帮助化学变性剂变性的包涵体蛋白进行正确折叠，从而提高包涵体蛋白的复性效率［10-11］。

2 分子伴侣范围的扩大

自分子伴侣的概念提出以来，分子伴侣的范围实际上一直在扩展。

王志珍院士对二硫键异构酶（protein disulfide isomerse，PDI）进行了系统研究，发现PDI既是酶又是分子伴侣，其不仅可以催化天然二硫键的形成，还可以作为分子伴侣来促进多肽链的正确折叠［12］。一些研究也发现肽酰脯氨酰顺反异构酶（peptidyl prolyl isomerse，PPI）家族的部分成员同样具有一定的伴侣功能，比如SlyD 可作为融合伴侣以及溶解度增强剂，在大肠杆菌的细胞质中促进蛋白质折叠，显著增强了许多易于聚集的异源蛋白质的溶解性［13］。大肠杆菌周质伴侣SurA同样也是一种肽酰脯氨酰顺反异构酶，已有研究表明，它可以促进外膜孔的正确折叠和成熟［14］，且其自身结构可选择性地结合特定底物［15］。本课题组研究了人亲环素18（human cyclophilin 18，hCyp18，一种分子质量为18 ku 的肽酰脯氨酰顺反异构酶）对人肌肌酸激酶（human creatine kinase，HCK）去折叠的影响作用，发现hCyp18能够抑制HCK的失活与构象变化，并有效缓解其在变性过程中的聚集，从而推断hCyp18 具有针对HCK 的分子伴侣功能［16］。

随着研究的逐渐深入，分子伴侣的范围也不再仅局限于蛋白质，核糖体、RNA 乃至一些磷脂都被鉴定出具有分子伴侣的活性。核糖体被认为是强大的伴侣，可帮助其上蛋白质合成过程中多肽链的折叠［17］。DNA和RNA在体外都表现出强的伴侣活性，其抑制经典的伴侣底物聚集的效率被报道比蛋白质类分子伴侣GroEL 高300 倍［18］。RNA 在体外行使伴侣功能的研究实例表明，传统伴侣以外的其他分子对于生物分子（包括核酸）的体内折叠可能具有重要作用［19-20］。

在以大肠杆菌突变体为模型来改变膜磷脂的组成时，缺乏磷脂酰乙醇胺（PE）会导致多聚膜蛋白乳糖通透酶LacY的错误折叠，PE可与部分变性的蛋白质在其重折叠时发生相互作用，表明磷脂可以作为非蛋白质类分子伴侣起作用［21-22］。变性的大肠杆菌外膜蛋白OmpA只在脂多糖（LPS）存在的情况下发生重折叠［23-24］，大肠杆菌周质蛋白DegP会依赖于特定的磷脂酰甘油（PG）发生构象变化，来防止未折叠蛋白质在低温下的自聚集［25-26］。具有分子伴侣功能的脂分子被命名为脂伴侣（lipochaperone）［26］。

一些蛋白质稳定剂（如甘油和其他多元醇）可通过增加蛋白质的水化作用而稳定其结构，从而提高蛋白质折叠的效率，被称为“化学分子伴侣”（chemical chaperones），它们作为小分子通常不直接与错误折叠的蛋白质相结合，具有非特异性且在高浓度下发挥作用［27-28］。化学分子伴侣一般可分为两类：渗透剂和疏水化合物。真核生物体内的渗透剂主要包括游离的氨基酸及氨基酸衍生物（例如甘氨酸、牛磺酸等）、多元醇（例如甘油、蔗糖等）和甲基胺（例如三甲基胺N-氧化物等）［27］。渗透剂通过结合水分子来增加蛋白质折叠态的稳定性［29］，已在体外和体内被广泛用于神经退行性疾病相关蛋白质的错误折叠与聚集的研究中，且具有一定的治疗效果［30-31］。本课题组已有的研究结果表明，蔗糖可在拥挤环境中抑制人肌肌酸激酶于折叠过程中产生的聚集，促进其正确折叠［32］，蔗糖也可在拥挤环境中提高肌酸激酶的稳定性［33］。蔗糖或甘油的添加能够有效抑制阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）相关的Tau 蛋白在稀溶液和大分子拥挤环境中的聚集［34］。毒性较低的疏水化合物也被作为治疗剂进行研究，例如4-苯基丁酸钠（PBA）已被美国食品和药物管理局（FDA）批准用于尿素循环障碍的治疗，PBA 可以作为口服补充剂使用且目前没有发现严重的副作用，但服用所需的高剂量问题仍待解决［27］。越来越多的研究表明，化学分子伴侣可以减少内质网应激，纠正抑癌蛋白p53的错误折叠并恢复葡萄糖稳态，抑制蛋白质和肽淀粉样蛋白的形成并稳定错误折叠的酶［28］。

一些蛋白水解酶的前导肽序列被称为“分子内分子伴侣”（intramolecular chaperone），这些前导肽对于水解酶的折叠和成熟是必需的，来自各种蛋白质的大量前导肽已被鉴定为分子内伴侣［35-36］。根据对蛋白质折叠的作用，分子内伴侣可分为两类：I 型分子内伴侣包括那些辅助蛋白质三级结构形成的分子伴侣，大多由N端序列延伸产生；II型分子内伴侣不直接参与三级结构的形成，但引导四级结构的组装，它们大多位于蛋白质的C端。与普通的分子伴侣相比，这种分子内分子伴侣具有高度的专一性［37］。

后来的研究发现，分子伴侣帮助的对象不局限于蛋白质，分子伴侣也可帮助其他生物大分子进行折叠。与DNA结合、帮助DNA分子进行预折叠或预扭曲，从而把DNA 稳定在一个适合与蛋白质结合的特定构象内的蛋白质，被称为“DNA 分子伴侣”［38］。帮助RNA 分子折叠的蛋白质被称为“RNA分子伴侣”，这些蛋白质与RNA结合后可以防止RNA 的错误折叠，或消除它们的错误折叠，从而促进RNA的正确折叠［39］。

3 具有分子伴侣功能的抗体

分子伴侣行使伴侣功能的基础是与靶蛋白的结合，而抗体通常对于抗原分子具有高度的亲和力，缔合常数在10-7~10-10mol/L范围内，因此天然具备了行使分子伴侣功能的可能。

早在1969 年就有研究发现，从用乙酰胆碱酯酶作为抗原免疫的动物中获得的抗体在与热失活的酯酶相互作用后，使其靶蛋白部分恢复了酶活性［40］，这提示可以利用抗体来诱导其靶蛋白的变性构象向近似天然的构象转变，从而使其复性。随着研究的深入，人们发现一些蛋白质，其中包括还原的S-蛋白（核糖核酸酶A 的片段）［41］、羧肽酶A［42］、辣根过氧化物酶［43-44］、萤火虫荧光素酶［45］等在变性后，可以被其抗体诱导，发生重折叠。一些抗体被发现可以抑制靶蛋白的折叠，如甘油醛-3-磷酸脱氢酶和肌酸激酶的部分单克隆抗体可以抑制它们在复性过程中的折叠［46-47］。抗体对于蛋白质折叠的影响依赖于其表位特性和蛋白质特定的折叠途径，并没有通用的机制。目前主要有三种假设的机制：a. 抗体稳定蛋白质的天然构象，使其靶蛋白的去折叠构象和天然构象之间的平衡向天然构象方向移动；b. 抗体通过屏蔽疏水表面来抑制靶蛋白折叠中间体的聚集；c. 抗体通过稳定过渡态结构降低折叠的活化屏障［48］。这些机制的确定需要根据具体情况来分析。

一些抗体在促进其靶蛋白正确折叠的同时还可以防止其聚集现象的发生［49-50］。值得注意的是，具有分子伴侣功能的抗体对于底物通常具有严格的特异性，而这恰恰与天然的分子伴侣相反，这使其在蛋白质错误折叠相关疾病的治疗中具有更大的应用潜力。错误折叠或聚集的蛋白质是神经退行性疾病治疗中的重要靶点，已有不少抗体被研发出来作为分子伴侣与错误折叠的蛋白质单体、寡聚体或聚集体相结合，有效缓解了相关疾病的发病进程（将在下文中进行详细叙述）。这其中针对全长抗体的大量研究表明，大尺寸的抗体不利于对血脑屏障的穿越及向组织的渗透，且容易被人体免疫系统所识别清除［51］。随着DNA重组技术的发展，许多重组抗体的片段被开发出来，其中最受青睐的是单链抗体。

4 具有分子伴侣功能的单链抗体

4.1 单链抗体

单 链 抗 体（single-chain fragment variable，scFv）是具有抗体活性的最小结构功能单位，由抗体的重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）通过一段柔性肽（linker）连接而成。单链抗体的主要优点在于分子质量小、穿透力强、特异性高等，与完整抗体及相关Fab片段相比，scFv能更好地穿透血脑屏障和渗透更大的实体肿瘤，scFv 的快速分布可加速其与靶位点的结合，且因缺少抗体的恒定区而减少了与其他非靶位点的结合，具有更小的免疫原性［52］。此外，由于scFv 不需要糖基化，它们可以在细菌表达系统中产生，从而可以进行大规模的生产［53］。近10年来，单链抗体已经成为被动免疫疗法的一种重要选择［54］，其在靶向治疗、影像诊断、细胞免疫、生物检测方面都有着重要应用［52］。

4.2 单链抗体的筛选方法

scFv可以根据其结合抗原的特异性从特定的文库中筛选出来，然后在多种表达系统中进行表达。噬菌体展示文库和核糖体展示文库是目前常用的文库，但每种文库都有其局限性，可依据筛选所需要的抗原性质和预期抗体的亲和力及数量来选择不同的文库。

噬菌体展示技术是用来筛选scFv 最常用的方法，根据抗体基因的来源，展示文库可分为免疫、天然、合成三种。免疫库（immune libraries）由不同种类的动物或人类的B淋巴细胞抗体基因构建而成，可以产生具有高亲和力和特异性的抗体，富集的抗体偏向于用于预防接种的抗原，其缺点是需要为每种新的抗原构建新的抗体库；天然库（native libraries）不偏向于任何抗原，单个库的容量若足够大且多样化便可以用于所有抗原，其主要缺点是必须克隆更大的文库；合成库（synthetic libraries）又称随机肽库（random peptide libraries），是将种系基因序列与负责结合抗原的随机互补决定区（complementary determining regions ，CDRs）基因序列融合在一起，在噬菌体表面表达出具有随机序列的短肽，已被广泛用于生产高亲和力的单克隆抗体、鉴定线性抗原表位或具有各种结合能力的其他分子［54-56］。噬菌体展示技术的关键优势在于实验表型（展示的蛋白质）与其封装的基因型（编码蛋白质的DNA）之间存在直接联系［57］。

核糖体展示技术也在逐渐成熟，因其是一种体外转录/翻译系统，克服了基于细胞方法的局限性，可以创建更大的文库并避免表达偏差［57-58］。核糖体展示技术在对一些具有聚集倾向的蛋白质筛选方面表现不佳，分泌蛋白也通常通过噬菌体展示技术来筛选。但也存在将两种技术合并的替代方法，例如在核糖体展示技术中从天然库或合成库中选择，这种方法可以在几天内用无细胞系统模拟抗体的生成和亲和力成熟过程，获得了比大多数天然抗体具有更高亲和力的分子［59-60］。

除此之外，微生物细胞展示技术也被用于scFv的筛选中，该系统的展示水平为每个细胞3×104个scFv，并且通过荧光激活细胞分选（fluorescenceactivated cell sorting，FACS）技术可以快速、定量地筛选及富集特异结合的蛋白质。与噬菌体和核糖体展示技术相比，FACS 消除了洗脱回收后紧密结合的克隆的不确定性，并消除了噬菌体展示中可能发生的非特异性结合［57］。酵母、大肠杆菌及苏云金芽孢杆菌孢子展示技术已被用于构建scFv 文库［61-63］，其中酵母展示系统应用得较为广泛［57］。

4.3 具有伴侣功能的单链抗体的筛选与应用

重组的单链抗体已被广泛应用于生物技术及治疗诊断领域，而具有分子伴侣功能的单链抗体可以帮助靶蛋白进行正确折叠，这使其在蛋白质的生产纯化及蛋白质错误折叠相关疾病的药物开发等方面具有较好的应用前景。

本课题组利用一个大容量的人源噬菌体单链抗体库，以人肌肌酸激酶为靶蛋白，筛选出一株具有双重伴侣功能的单链抗体（scFv A4），该抗体能显著抑制肌酸激酶在折叠过程中的聚集，并促进肌酸激酶天然构象的恢复，该抗体同时能抑制天然肌酸激酶在热变性过程中的失活与聚集，可视为针对肌酸激酶的专一性分子伴侣［64］。我们采用计算机模拟方法构建了scFv A4 与肌酸激酶的复合物模型，探索了肌酸激酶可被scFv A4识别的表位和scFv A4的作用机制［65］。在上述工作的基础上，我们应用固相多肽膜筛选技术、表面等离子体共振技术与酶联免疫吸附测定技术，获得了可与scFv A4 特异结合的肌酸激酶多肽片段，这些多肽片段作为竞争者，可促使肌酸激酶-scFv A4复合物解离，释放肌酸激酶，成功实现肌酸激酶的高效折叠与复性。分子机制研究表明，scFv A4 与筛选出的多肽可组成一套完整的伴侣体系，先加入的scFv A4 负责结合靶蛋白的折叠中间体，阻止其聚集，后加入的多肽促进靶蛋白的释放与复性（图1）。这种单链抗体-多肽体系是一种全新的分子伴侣体系，其最大的优点是专一性强，只帮助其靶蛋白进行折叠［66］。应用该伴侣体系，结合亲和层析技术，我们设计了一套柱上复性的体系，用于帮助人肌肌酸激酶包涵体的纯化与制备，取得了较好的成效［67］。

Fig. 1 Construction and mechanism of scFv A4-peptide chaperone system图1 scFv A4-多肽伴侣体系的构建与作用机制

5 抑制蛋白质聚集的抗体的伴侣功能

基于广义的分子伴侣概念来说，能够抑制折叠病相关蛋白质聚集的抗体等生物分子也可以视为具有伴侣功能。错误折叠的蛋白质积累被认为是神经退行性疾病中的关键事件，这些疾病也被称为折叠病，比如帕金森病（Parkinson's disease，PD）被发现与α突触核蛋白（α-synuclein，α-syn）的异常聚集有密切关联［68］，AD 则 与β淀粉样肽（amyloid β，Aβ）和Tau 蛋白的聚集关系紧密［69］，肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）与Cu/Zn 超氧化物歧化酶（SOD1）、TAR DNA 结合蛋白43（TDP-43）等蛋白质的聚集密切相关［70-71］。异常聚集形成的淀粉样蛋白最开始是由富含天然α螺旋的可溶性蛋白质转变为富含致病性β 折叠的蛋白质，通过成核和生长形成寡聚体、原纤维缠结等，最后形成淀粉样纤维聚集体。寡聚体和原纤维是导致神经元功能障碍和死亡的毒性物质，目前折叠病的治疗目标主要针对于蛋白质单体、寡聚体和原纤维［72］。针对上述蛋白质筛选出的抗体研究进展如下所述。

5.1 α突触核蛋白

PD 是仅次于AD 的常见神经退行性疾病，目前暂无有效的治疗方法［73］。α-syn 的聚集体是PD病理相关的路易体和路易神经突的主要成分，可溶性的α-syn 错误折叠并聚集成寡聚体，继而形成淀粉样原纤维，最后形成路易体。寡聚体形式是目前认为具有较强毒性的状态［74］，寡聚体已被证实可以通过多种方式产生细胞毒性，包括导致线粒体功能障碍、内质网应激、蛋白质平衡丧失、突触障碍、细胞凋亡和神经炎症［75］。

之前针对α-syn 的研究主要集中在筛选能够抑制其单体聚集的抗体方面，在体外通过噬菌体展示或酵母表面展示技术筛选出与人重组单体α-syn 具有高亲和力的scFv D10、NAC32 等单链抗体，其与α-syn在哺乳动物细胞中的共表达可稳定α-syn单体，防止其聚集并改善了α-syn 过表达引起的细胞毒性［76-77］。

随着寡聚体的毒性被证实，以寡聚体为治疗目标的研究逐渐增多。Emadi 等［78］利用噬菌体展示技术和原子力显微镜（AFM）等技术分离出了与α-syn的寡聚形式特异性结合的scFv D5，其可以有效抑制α-syn 的聚集并阻断聚集的α-syn 的细胞毒性。更多靶向α-syn 寡聚体的特异性单克隆抗体被研发，它们不识别线性表位，只识别具有特定构象的寡聚α-syn［79］。一种单链抗体scFv W20 被发现可以识别Aβ、α-syn、淀粉样蛋白、朊病毒蛋白等蛋白质组装而成的各种寡聚体，抑制寡聚体诱导的细胞毒性，同时改善AD、PD和亨廷顿病小鼠模型的运动和认知功能，并通过减少相应蛋白质的聚集负荷和防止突触变性来减弱许多神经病理学特征［80-82］。特异性识别α-syn 原纤维和寡聚体的scFv-pF 和scFv-pC 可以抑制胞内α-syn 种子的毒性传播并阻断α-syn的聚集［83］。

5.2 β淀粉样肽（Aβ）

AD 作为最常见的神经退行性疾病，主要的病理特征为胞外的Aβ 沉积形成的斑块和胞内Tau 蛋白过度磷酸化后形成的神经纤维缠结。被动免疫疗法是目前治疗AD 的研究中常用的方法。针对Aβ开发的抗体依据识别的抗原表位的位置可分为4类：a. 靶向Aβ N 端区域（氨基酸1~16）的抗体，其可以识别Aβ 形成过程中所有的结构形式，如单体、寡聚体、原纤维、淀粉样蛋白等；b. 靶向Aβ中间区域（氨基酸17~32）的抗体，只识别Aβ 单体；c. 靶向Aβ C 端区域（氨基酸33~42）的抗体，其可以进入中枢神经系统及在外周发挥作用，促进Aβ 的清除；d. 靶向构象表位（寡聚物与原纤维）的抗体［84-85］。

早期使用的常规单克隆抗体证实了免疫疗法的潜力，但也有很大的局限性，比如穿过血脑屏障的渗透性低，在鼠和人类中引起了一系列不良反应，包括脑膜炎、血管源性水肿、脑微出血等，而重组抗体因其结构的独特优势使其在AD模型鼠和灵长类动物的实验中表现良好［84］。靶向Aβ不同表位的scFv单链抗体在各种AD小鼠模型中都表现出了治疗功能，Fukuchi 等［86］将抗Aβ 的scFv59 基因利用腺相关病毒（AAV）载入小鼠皮质海马区，发现scFv59可以在海马神经元中长期稳定表达并抑制了Aβ的沉积。

ScFv因其较短的半衰期，具有较高的安全性，但同时也影响了治疗剂量，目前大部分scFv 都是通过AAV 载体注射进小鼠脑区。Ryan 等［87］用识别Aβ 单体和寡聚体的Aβ-scFv 改善了3×Tg-AD 小鼠的认知障碍，Levites 等［88］将scFv9、scFv40.1、scFv42.2 通过AAV 注射进新生小鼠P0 脑中，实现了永久稳定的表达，减少了Aβ 的沉积，且无毒副作用。Roda 等［89］证实了scFv-h3D6 不仅可以减少3×Tg-AD 小鼠脑中的淀粉样斑块，还可以降低脑中病理Tau蛋白的水平。尽管AAV递送的方法在小鼠模型中取得了不错的成果，但在人类治疗中往往需要侵入性较小的给药途径，Wang等［90］采用肌内注射方式给药scFv 到APPSwe/PS1dE9 转基因小鼠中，结果表明，scFv 显著减弱了Aβ 斑块的形成积累、AD病理和认知障碍，并且发现，动物对肌内注射有良好的耐受性，不会在表达位点及脑中引起炎症或微出血。

5.3 Tau蛋白

病理性Tau蛋白的聚集体是几种神经退行性疾病中神经纤维缠结的主要成分，这类神经退行性疾病统称为Tau蛋白病。根据AD的病理特征，Tau蛋白也是AD治疗的一个重要靶标，在目前的scFv被动免疫研究中主要靶向的是总Tau 蛋白、磷酸化Tau 蛋白（pTau）和Tau 寡聚体。已有不少研究在疾病相关的动物模型中取得了不错的进展，Yanamandra 等［91］先是开发出了可以有效阻断Tau蛋白种子传播活性的、并能改善模型小鼠认知障碍的抗Tau 抗体HJ8.5，随后Ising 等［92］基于HJ8.5 筛选出了两种抗Tau scFv（SC1和SC3），结果发现两种scFv均可以显著降低P301S-tg小鼠病理性的Tau蛋白水平。Krishnaswamy等［93］则证明了可以使用人类Tau 蛋白病R406W 突变的转基因果蝇来表征抗Tau scFv 的治疗效果，scFv235 的表达可以延长R406W 模型果蝇的寿命，并有效阻止了病蝇翅膀和腹部表型的病情发展，同时减少了果蝇模型中病理性Tau蛋白的表达水平。

Tau 蛋白根据其包含的重复序列数目可分为3RTau 和4RTau 两类［94］。它们在Tau 蛋白疾病中差异表达，其中AD 与额颞叶痴呆病（FTDP-17T）患者脑内均有3RTau和4RTau的积累。目前大部分研究围绕4RTau 展开，但Spencer 等［95］表明靶向3RTau的scFv也有不错的治疗效果，他们通过构建具有脑穿透序列（apoB）的重组3RTau scFv 慢病毒载体来实现脑内递送，发现3RT-apoB scFv 可以渗透到中枢神经系统，并有效减弱了3RTau tg模型小鼠中3RTau的积累和神经变性的发生，这在治疗富含3RTau的神经退行性疾病（如Pick病）方面具有一定的潜在应用价值。

除了研发靶向Tau蛋白的抗体以外，以寡聚体和pTau 蛋白为靶点的研究也在不断发展。Venkataraman 等［96］筛选出了只识别Tau 寡聚体的三种scFv（F9T、D11C与H2A），并验证了它们可以将AD 小鼠和AD 患者脑组织与正常小鼠和人类脑组织区分开。Abskharon 等［97］则报告了一种能够特异性识别Tau 寡聚体的M204-scFv，其可以有效抑制AD 患者脑提取物中的Tau 蛋白聚集，同时他们还表明该scFv 本身可分为抑制播种的单体、二聚体、三聚体形式，X射线晶体结构暗示了二聚体和三聚体可能具有更好的结合和抑制Tau寡聚体的能力。Zhang 等［98］获得一种靶向pTau 蛋白的scFv，并证实通过AAV 递送到小鼠脑中可以稳定表达至少22周。

本课题组以pTau 蛋白为靶蛋白，利用大容量的人源噬菌体抗体库，筛选得到了一种scFv 单链抗体，该抗体能特异性地抑制pTau 蛋白的聚集，促进pTau 蛋白聚集体的解聚，并且能够降低pTau蛋白聚集体的细胞毒性，当其在AD模型果蝇眼睛中特异性地表达后，可以缓解hTauR406W导致的毒性，具有很好的用于治疗AD 的潜在应用价值（图2），目前正进一步研究其作用机制，并利用多种细胞模型和AD 模型小鼠验证其功能与活性［99］。

Fig. 2 Screening and application of scFv T1 inhibiting aggregation of pTau protein图2 抑制pTau蛋白聚集的单链抗体scFv T1的筛选与应用

在抗体的递送方式上也有不同的选择，Vitale等［100］先是选用了AAV 将scFv-MC1 递送至成年JNPL3 小鼠海马中，scFv-MC1 在皮质、海马和后脑都显著减少了可溶性、寡聚和不溶性Tau蛋白的表达水平。为了优化递送方法，他们进一步选用肌内注射这种外周给药方式，发现肌内注射AAV1-scFv-MC1 可以持久产生抗Tau 的scFv-MC1，并显著减少了大脑中的可溶性和不溶性Tau的水平，这为治疗AD以及其他神经退行性疾病提供了新的思路［101］。除此之外，Guell-Bosch 等［102］使用先前所述的scFv-h3D6对3xTg-AD小鼠进行每月腹腔给药治疗，在治疗期间他们采取了磁共振成像和光谱学（MRI/MRS）的手段来跨时间段监测小鼠的病情发展，这种非侵入性的方式为量化抗体的治疗效果提供了新的方法。最近的研究还显示了一项基于双特异性串联scFv（TaFv）的AD 疗法，Qian 等［103］利用大肠杆菌表达系统获得了可以同时靶向Aβ 和p-Tau 的TaFv，证实其可以与AD 小鼠模型脑切片中的淀粉样斑块和神经元缠结相结合。但大多数免疫疗法对于清除胞质中的病理性Tau蛋白具有一定的局限性。最近，也有研究选用细胞内表达的抗体以期望更好地清除胞内Tau 蛋白的病理形式。Gallardo 等［104］基于抗Tau scFv 开发了一种融合突变泛素的抗Tau 嵌合胞内抗体（intrabodies，iBs），发现iBs与突变泛素的融合可以增强蛋白酶体的靶向作用，经AAV 递送后可以显著降低P301S 转基因小鼠特定海马亚区病理性Tau 的表达水平。随后，Goodwin 等［105］对scFv 和iBs 进行了功效的比较，他们利用pTau蛋白和总Tau蛋白的特异性抗体生成特定的scFv 和iBs，结果显示pTau 特异性iBs和scFv的表达均可预防JNPL3小鼠中Tau病理的发生并延缓后肢瘫痪的进程，但在rTg4510模型鼠中只有pTau 特异性iBs 有效减弱了病理Tau 蛋白的积累。显然这些研究提供了一种新型的免疫治疗方法，未来有必要进行更多的研究来优化靶向Tau蛋白的重组抗体片段和递送载体。

5.4 针对其他蛋白质的抗体

ALS发病机制的关键基础也是蛋白质的错误折叠与聚集，突变的超氧化物歧化酶1（SOD1）和TDP-43 分别是家族性和散发性ALS 的主要致病蛋白质。单克隆抗体D3H5 和D3-1 都是突变蛋白SOD1G93A的特异性抗体，研究发现，它们的重组scFv抗体具有更好的治疗效果，Patel等［106］通过单次鞘内注射重组AAV-scFvD3H5 至SOD1G93A小鼠中，发现scFv D3H5 有效延迟了疾病发作的时间，并减缓了神经胶质的增生和运动神经元的衰减。最近，Minamiyama 等［107］利用了少突胶质前体细胞（oligodendrocyte precursor cells，OPCs）作为scFv D3-1 的药物递送载体，发现鞘内单次注射表达scFvD3-1的OPCs可显著延迟SOD1H46RALS大鼠模型的疾病发作并延长寿命，这意味着使用OPCs作为治疗性抗体的递送载体是治疗ALS 的一种新选择。

针对ALS 的另一种关键蛋白TDP-43 错误定位或错误折叠的分子表位E246 和D247，Tamaki等［108］开发出了TDP-43 错误折叠特异性单克隆抗体3B12A，随后证实了3B12A scFv 具有双重蛋白质水解信号，可以加速TDP-43 聚集体的降解，并通过子宫内电穿孔的递送方式进行给药，发现3B12A scFv可以减少胚胎小鼠大脑中的TDO-43聚集体，且没有出现异常的产后脑部病理和发育异常。

朊蛋白相关折叠病的标志是正常细胞表达的朊蛋白PrPC转化成了病理性构象PrPSc，多项研究使用scFv 靶向PrPSc，抑制其聚集并降低了PrPSc的相关毒性［72］。Filesil 等［109］用PC12 细胞表达抗朊病毒的8H4-scFv，发现其可以抑制细胞中PrPSc的积累。Fujita 等［110］建立了稳定表达抗-PrP 3S9 scFv的Ra2小胶质细胞系，将其注射到小鼠脑区，发现其显著延长了小鼠的寿命，且未观察到自身免疫反应。这些结果同时也展现了真核细胞作为scFv 递送途径的治疗潜力。

目前针对各种折叠病相关靶蛋白抗体的筛选和研究正在积极进行，相信在这一领域，将会出现具有重要应用价值的治疗性生物药物，对具有伴侣功能的抗体的研究也将产生重要的理论研究和应用价值。