黄瓜bZIP 基因家族鉴定及功能分析

范鹏飞，赵丽君，王月玲，许娜娜，胡瑞坤，陈明月，张梦瑶，杨路明，杨 森

（河南农业大学园艺学院 郑州 450002）

碱性亮氨酸拉链（bZIP）转录因子家族是规模最大、种类最多的家族之一。bZIP 转录因子（bZIP-TFs）具有保守的bZIP 结构域，由2 个结构特征组成：特异结合DNA 的基本区域和亮氨酸拉链二聚基序的基本区域[1]。除了bZIP 结构域外，bZIP 转录因子还有其他一些结构域，如富含谷氨酰胺的基序和磷酸化位点[R/KxxS/T][2]。为了与DNA 结合，基本区域的N 端一半与双链DNA 的主槽结合，而Leu 拉链的C 端一半通过二聚作用形成重叠的卷曲结构。目前，bZIP 家族成员已在植物、动物和酵母等多种真核生物基因组中得到鉴定或预测。据报道，bZIP 转录因子参与了胁迫生长条件下的发育和生理过程，被认为是应对各种非生物胁迫的重要调节因子，如拟南芥[3]、水稻[4]、小麦[5]、番茄[6]、辣椒[7]、大豆[8]和玉米[9]中的干旱、高盐和低温胁迫。此外，bZIP 转录因子在响应信号通路也发挥着重要作用，包括ABA 信号、光信号、渗透和病原体感染[10]。因此，它们对各种植物抵御不利的环境条件非常重要[1]。在植物中，bZIP 蛋白除了响应各种生物/非生物胁迫外，还在生长和发育中发挥重要作用[11]。在发育过程中，bZIP-TFs 在器官和组织分化、细胞伸长、氮/碳和能量代谢、未折叠蛋白应答、种子贮藏蛋白基因调控体细胞胚胎发生等方面起着关键作用[12-17]。

黄瓜（Cucumis sativusL.）是葫芦科甜瓜属一年生草本植物，在全世界范围内广泛种植，同时也是我国设施栽培的主要蔬菜种类之一。华北型黄瓜、华南型黄瓜和欧洲温室型黄瓜是我国市面上常见的几类黄瓜品种。相对于光滑无刺的欧洲温室黄瓜果实，华北型和华南型黄瓜果实表面密集着生大量果刺。“顶花带刺”是中国消费者挑选华北型黄瓜的一大标准，因此，果刺密度及大小逐渐成为黄瓜果实重要的外观品质性状，已经成为改善黄瓜果实商品品质的主要目标[18-19]。就黄瓜果刺形成而言，其发育过程可分为果刺的起始、基座膨大、成熟和衰老等4 个阶段，其中，每个阶段都可能会涉及不同的基因参与调控[20]。目前为止，已被报道的调控黄瓜果刺发育的基因涉及HD-ZIP 家族、MYB 家族、C2H2 锌指蛋白、WD-repeat 蛋白以及bHLH 家族基因等不同基因家族的成员[21-23]。植物激素也被报道调节黄瓜果刺性状起始和分化阶段，包括赤霉素、细胞分裂素、生长素和乙烯途径都参与了黄瓜果刺的发育[21]。黄瓜果刺性状已然挖掘到许多相关基因和激素通路，但光照、温度以及水肥等外界因素对果刺的影响仍然不清楚。bZIP 转录因子在生物/非生物胁迫以及响应信号通路中发挥着重要作用，但黄瓜bZIP家族基因的研究还较少，有关其功能还不清楚。笔者通过全基因组分析鉴定出黄瓜bZIP家族基因，结合果刺突变体材料的转录组测序数据分析和异源转化回补拟南芥突变体表型观察，表明黄瓜bZIP基因家族中CsaV3_2G031960和CsaV3_3G046530基因在黄瓜表皮毛发育过程中可能具有调控作用，研究结果可为后续开展CsbZIPs对黄瓜表皮毛调控的分子机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料和处理方法

黄瓜大果刺基座L-SB 及近等基因系小果刺基座S-SB 材料均由河南农业大学瓜类分子育种实验室提供。拟南芥突变体从突变体库（http：//www.arashare.cn/index/Product/index.html）购买获得。

试验于2022 年5－10 月在河南农业大学园艺学院分子瓜类育种实验室进行。拟南芥（Arabidopsis thaliana）野生型Col 及突变体材料，均使用酒精消毒30～60 s 后，清水清洗2～3 遍，然后使用3%NaClO 溶液消毒15 min，期间不停晃动，之后灭菌水清洗3～5 遍，播种于MS 培养基中。4 ℃冰箱放置3 d 后放入组培室（光照16 h，黑暗8 h，恒温25 ℃）中培养，待长至2～4 片真叶时挑选根系健壮的幼苗移栽至基质中。光照培养箱中（日温24 ℃，夜温16 ℃，光照16 h，黑暗8 h）正常生长，每隔1周浇水1 次[24]。

1.2 黄瓜bZIP基因家族成员鉴定

将拟南芥数据库（http：//www.arabidopsis.org）中已知的20 个bZIP基因保守序列，通过TBtools软件Blast 搜索获得黄瓜bZIP候选基因。此外，在葫芦科数据库（http：//www.cucurbitgenomics.org/）使用关键词bZIP检索。从PFAM 数据库下载bZIP结构域的HMMER 文件，从黄瓜基因组中提取具有bZIP结构域的蛋白序列。三者结合，最终确定黄瓜bZIP家族成员。

1.3 系统发育分析

分别从葫芦科数据库和拟南芥数据库下载了bZIP 蛋白序列，利用MEGA 7.0 构建系统进化树，其中聚类分析使用邻接法Neighbor-Joining，进行Bootstrap 测试，重复数为1000，进化距离的计算方法为Poisson model。利用AI 工具进行美化。

1.4 保守结构域分析

应用MEME（https：//meme-suite.org/meme/）预测分析bZIP 蛋白序列的结构域，搜寻Motif 值设置为10，结构域宽度设定为最小10、最大100，其他参数为默认值。再利用TBtools 对保守结构域进行筛选和可视化[25]。

1.5 染色体定位

从葫芦科数据库下载黄瓜bZIP基因文件，根据基因组注释文件中提供的位置信息，将所有黄瓜bZIP基因定位到相应的染色体上。利用TBtools软件绘制出染色体分布图[26]。根据bZIP基因在每条染色体上分布个数进行量化统计。

1.6 黄瓜bZIP基因家族qRT-PCR分析

根据黄瓜bZIP基因的 CDS 序列设计qRT-PCR 引物（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，使用华越洋RNA 提取试剂盒提取总RNA，并使用诺维赞反转录试剂盒反转录得到cDNA。使用NCBI 中的primer-blast 功能设计CsbZIPs的特异性定量引物，按照诺维赞荧光定量PCR 试剂盒步骤，以黄瓜cDNA 为模板检测CsbZIPs成员的表达量。基因相对表达量按照2-△△Ct方法计算[27]。其中，内参基因为CsACTIN，每个检测的样本都设置了3 个生物学重复和3 个技术重复，绘图使用GraphPad Prism 软件。

表1 引物序列信息

1.7 拟南芥遗传转化

过量表达载体的构建：从黄瓜cDNA 中克隆得到CsaV3_2G031960和CsaV3_3G046530CDS 序列，将此片段连接到pFGC5941 载体酶切位点AscI和PacI之间，构建35S：：CsaV3_2G031960和35S：：CsaV3_3G046530过量表达载体，将载体转化农杆菌感受态GV3101。

拟南芥遗传转化[28]：根据上述拟南芥播种方法播种拟南芥Atbzip56突变体，待拟南芥长出5 cm主茎时剪去主茎，促使拟南芥长出更多的侧枝，等拟南芥长至10～15 cm 时剪去所有露白和开放的花以及荚果，按照花序侵染法流程，侵染拟南芥。黑暗18～22 h 后正常生长，约30 d 后收获T1种子。将T1代种子根据上述拟南芥播种方法播种在质量浓度为20 mg·L-1Basta 的MS 培养基上，待长至2～4片真叶时仍然生长健壮的幼苗移栽至基质中，随后进行DNA 鉴定，获得的阳性苗可在显微镜下进行表型观察。

2 结果与分析

2.1 黄瓜基因组中bZIP 基因家族TFs 的鉴定及染色体分布

利用生物信息学方法，在黄瓜全基因组中鉴定得到75 个黄瓜bZIP 转录因子。Basic region 和Leucine zipper 是bZIP 转录因子都具有的2 个保守结构域（图1-A）。利用TBtools 软件绘制出黄瓜bZIP基因家族的染色体分布图。75 个CsbZIPs 转录因子不均匀地分布在7 个染色体上（图1-B）。在6 号染色体上bZIP 转录因子分布最多，占总数的21.3%；在1 号染色体上bZIP 转录因子分布最少，占总数的6.7%，其中3 个bZIP 转录因子没有组装到任何一条染色体上（图1-C）。CsbZIPs基因在个体染色体上的分布模式也表明某些物理区域具有相对较多的基因簇积累。除了1 号染色体外，其他染色体的bZIP 转录因子更多地聚集在臂的上端或者下端。

图1 黄瓜bZIP 基因家族染色体的分布

2.2 黄瓜基因组中bZIP基因家族系统进化分析

为确定黄瓜bZIP基因家族成员系统进化关系，利用MEGA 7.0 软件，采用邻接法（NJ）进行了黄瓜和拟南芥2 个物种95 条bZIP 蛋白质序列系统发育分析。与拟南芥相比，黄瓜bZIPs 转录因子同样可分为A、B、C、D、E、F、G、H、I 和S 共10 组（图2），每组bZIP 蛋白的数量分别为11、2、4、16、6、5、4、2、9、15。

图2 黄瓜与拟南芥bZIP 转录因子家族系统进化分析

2.3 黄瓜bZIP家族保守基序分析

利用MEME 网站对黄瓜bZIP基因家族的蛋白序列进行保守Motif 分析，利用NCBI 对黄瓜bZIP基因家族进行结构域分析（图3-A）。在Motif分析中，除包含bZIP 转录因子保守的结构域外，还有其他的保守基序，共测出了包括bZIP 结构域（Motif 1 和Motif 7）在内的10 个基序（图3-B）。在结构域分析中，bZIP 成员不仅具有bZIP 相关的功能，也具有其他的潜在功能，被系统进化分析分为同一组的bZIP 成员都预测到了相同的功能。综上所述，除了bZIP 结构域区域外，有一些bZIP 转录因子通常还含有额外的保守基序，这些基序可能指示潜在的功能位点或参与激活bZIP 蛋白的功能。

图3 黄瓜bZIP 基因家族蛋白保守结构域及bZIP 转录因子保守结构域Motif 1 和Motif 7

2.4 黄瓜不同果刺突变体及关键调控基因转基因植株的转录组数据分析

GLABROUS 1（CsGL1）是果刺形态建成的关键基因，Csgl1突变体植株地上部分表现为“光滑无毛”的表型，通过细致观察可发现其子房等地上部位组织器官表面密集覆盖着大量体积变小的、发育畸形的表皮毛。WD-Repeat 转录因子CsTTG1和SPINE BASE SIZE 1（CsSBS1）被发现能够与CsGL1形成三聚体复合物共同调控果刺形态建成。因此，为了解bZIP 转录因子在调节表皮毛发育中的潜在作用，首先对Csgl1突变体转录组数据进行了分析，共筛选出CsaV3_1G039550、CsaV3_1G014770和CsaV3_4G005470等3 个bZIP差异基因；同样，在CsTTG1过表达植株子房转录组测序中也筛选到bZIP差异基因，包括CsaV3_1G014770、CsaV3_5G033640、CsaV3_3G000600、CsaV3_2G004160、CsaV3_7G003290和CsaV3_3G045480（表2）。另外，笔者课题组前期构建了一对果刺大小不同的近等基因系材料L-SB 和S-SB，利用其F2群体，挖掘得到果刺大小基因CsSBS1。对大果刺基座材料L-SB 和小果刺基座材料S-SB 幼嫩子房进行转录组分析，筛选得到CsaV3_1G039550、CsaV3_2G029010、CsaV3_3G000600、CsaV3_4G004890、CsaV3_5G033640、CsaV3_6G014980和CsaV3_7G003290等7 个bZIP差异基因。之后又对CsSBS1-RNAi 转基因植株的子房转录组数据进行分析，筛选得到CsaV3_2G029010、CsaV3_4G005470、CsaV3_4G033330、CsaV3_5G033640和CsaV3_7G029950等5 个bZIP差异基因，其中，CsaV3_2G029010、CsaV3_5G033640和CsaV3_7G029950基因在亲本和CsSBS1-RNAi 转基因植株中均被筛选到，表明三者可能参与到了黄瓜表皮毛发育过程中（表2，图4）。

图4 转录组上bZIP 转录因子差异表达基因的热图

表2 不同转录组中筛选bZIP 差异基因

2.5 黄瓜bZIP基因的相对表达量分析

为了进一步确定bZIP 转录因子在L-SB 和S-SB 黄瓜材料中的表达差异，利用实时荧光定量PCR 技术，检测了上述筛选出的bZIP差异基因在L-SB 和S-SB 子房中的差异表达，结果表明，CsaV3_3G000600、CsaV3_7G003290、CsaV3_2G029010、CsaV3_4G004890、CsaV3_2G031960和CsaV3_3G046530等6 个bZIP基因在亲本中表达量有显著差异，与转录组数据一致，表明这6 个基因可能参与调控黄瓜表皮毛发育过程（图5）。

图5 黄瓜bZIP 转录因子在果刺中的的相对表达量

2.6 拟南芥bzip 突变体量化统计及黄瓜bZIP 基因的异源转化

为进一步确定CsaV3_3G000600、CsaV3_7G003290、CsaV3_2G029010、CsaV3_4G004890、CsaV3_2G031960和CsaV3_3G046530等6 个bZIP差异基因是否参与表皮毛的发育，笔者首先对CsaV3_7G003290、CsaV3_4G004890、CsaV3_2G031960和CsaV3_3G046530的拟南芥同源基因突变体进行了表型观察（图6-A～B），其中，Atbzip61（CsaV3_7G003290同源基因突变体）、Atbzip47（CsaV3_4G004890的同源基因突变体）以及Atbzip56（CsaV3_2G031960和CsaV3_3G046530共同的同源基因突变体）三种突变体与野生型相比（图6-C），Atbzip47和Atbzip56两个突变体植株主茎上表皮毛数量明显减少，表皮毛外观形态没有明显改变，Atbzip61突变体植株主茎上表皮毛数量未发生改变，表皮毛外观形态发生了明显变化，含有两个分支的表皮毛数量显著增加（图6-D）。以上结果表明，AtbZIP47和AtbZIP56促进拟南芥主茎表皮毛的发育，而AtbZIP61则抑制拟南芥主茎表皮毛分支的形成。另外，笔者构建了黄瓜bZIP基因CsaV3_2G031960和CsaV3_3G046530的过表达载体，分别转化到其对应的拟南芥同源基因突变体Atbzip56中，对筛选得到的转基因植株进行表型观察，结果表明两个基因的过量表达均回补了Atbzip56突变体茎表皮毛减少的表型（图6-D）。以上结果表明，拟南芥和黄瓜bZIP 转录因子对表皮毛发育具有保守功能，同时预示着黄瓜CsaV3_2G031960和CsaV3_3G046530两个基因在黄瓜表皮毛发育过程中发挥着重要的调节作用。

图6 拟南芥突变体的表型观察与量化统计

3 讨论与结论

笔者的研究从黄瓜全基因组中分析鉴定得到75 个bZIP基因，与拟南芥（Arabidopsis thaliana75）[29]、黄花蒿（Artemisia annua78）[30]中bZIP 转录因子数量相近。系统进化分析，黄瓜bZIP 家族可分为10 个亚族和一个未分组成员，除个别亚族外，每组成员数量占家族总成员的百分比与拟南芥相近，这可能预示着2 个物种同一组别的bZIP基因有相似的功能。黄瓜bZIP 家族进化过程比较保守，正如一些早期研究中所报道的，在拟南芥[29]、蓖麻[31]、玉米[32]和水稻[33]中发现了bZIP 结构域以外的多种保守基序，在黄瓜中也具有相同的研究结果。在结果域分析中，被系统进化分析分为同一组的bZIP 成员都预测到了相同的功能，这也说明同组的bZIP 成员在某些方面可能发挥着同样的作用。

bZIP 蛋白在生物/非生物胁迫和信号通路中发挥着重要作用。目前，也陆续报道了bZIP 转录因子参与调控表皮毛的研究结果。在拟南芥Atbzip25和Atbzip53突变体中，与野生型相比，表皮细胞（PC）和毛状体细胞（TC）的密度分别增加和减少[34]。AtbZIP25和AtbZIP53在拟南芥系统进化树中分别属于C 组和S 组，黄瓜bZIP 家族与拟南芥有着高度的相似性，在黄瓜bZIP 家族的C 组和S组可能也具有调控表皮细胞和毛状体细胞的功能，但是否具有其他功能还需进一步验证。笔者的研究通过果刺突变体材料的转录组测序数据分析筛选出了CsaV3_2G031960和CsaV3_3G046530两个bZIP差异基因，两个基因表达量在不同果刺材料中具有显著差异，在进化树中属于H 组与AtbZIP56（HY5）分于同一小支。在拟南芥中，AtHY5不仅能直接调节CHS、F3H 和F3′H 等花青素结构基因的表达[35]，还可以与MYB 等转录因子的启动子结合，间接调控花青素相关基因的表达[36]；在青蒿中，Aa-HY5被发现能够通过影响表皮毛的发育进而影响青蒿素的分泌量[37]。

笔者试验中的差异基因均是在果刺突变体材料的转录组中筛选得到的，对差异基因拟南芥同源基因表型应观察角果处表皮毛的变化，但拟南芥野生型和突变体植株角果处均未发现表皮毛的存在，早期研究表明，GLABROUS INFLORESCENCE STEMS 3（AtGIS3）、ZINC FINGER PROTEIN 6（AtZFP6）等在拟南芥中主要调节茎秆表皮毛发育[38]，因此，笔者主要观察了茎秆处表皮毛的变化。笔者研究发现，CsaV3_2G031960和CsaV3_3G046530两个基因的过表达均回补了拟南芥bzip56突变体主茎表皮毛数量减少的表型，证明二者均有可能参与到对黄瓜表皮毛发育的调控。但现在黄瓜转基因技术还不成熟，由于转化效率低、嵌合率高等问题，黄瓜转基因，尤其是基因编辑载体转化仍面临着较大的挑战。后期也将对筛选得到的bZIP 转录因子进行黄瓜转基因验证，以期明确其在黄瓜表皮毛发育中的具体功能。

笔者利用生物信息学方法对黄瓜bZIP家族基因进行鉴定，并分析了他们的染色体定位、保守基序、功能预测以及进化关系等，对黄瓜bZIP家族基因有了初步了解。结合果刺突变体材料的转录组测序数据分析和异源转化回补拟南芥突变体表型观察，筛选到了在黄瓜表皮毛发育过程中可能具有调控作用的2 个基因CsaV3_2G031960和CsaV3_3G046530。黄瓜bZIP基因家族的鉴定和基因筛选不仅有助于深入了解黄瓜表皮毛的分子机制，而且为未来研究bZIP 转录因子对黄瓜表皮毛的调控奠定了基础。