木薯叶黄酮醇检测方法优化及其含量比较分析

王琴飞 林立铭 薛茂富 张金泉 余厚美 张振文

摘  要：木薯葉富含丰富的黄酮醇类物质，高效的提取和分析方法可为获取木薯叶黄酮醇提供至关重要的评价技术。本研究旨在优化木薯叶中4种黄酮醇物质（杨梅苷、芦丁、烟花苷和水仙苷）的提取和检测方法，以及分析不同木薯品种、采收期和成熟度对这些黄酮醇含量的影响。结果表明：使用50%乙醇水溶液，料液比为1∶50（g/mL），超声提取温度50 ℃，超声提取时间60 min可有效提取木薯叶中的4种黄酮醇；不同的C18色谱柱配备HPLC-DAD能有效分离木薯叶中的4种黄酮醇；方法验证结果显示，4种黄酮醇在一定浓度范围内线性相关性良好，R2分别达到0.9999、0.9999、0.9999和0.9998；检出限在6.0～10.0 mg/kg之间；定量限在20.0～32.0 mg/kg之间；检测方法系统适应性较好，保留时间和峰面积变化相对标准偏差（RSD）均小于1%；样品日内、日间和月内稳定性较好，含量变化RSD在0.44%～3.57%之间，平均加标回收率在92.68%～109.14%之间，RSD均小于6.0%。利用建立的提取和分析方法，分析了30个木薯种质中4种黄酮醇含量，芦丁和烟花苷含量占4种黄酮醇总量的93.50%～99.30%，其含量高低由芦丁和烟花苷决定，但品种间决定黄酮醇总含量高低的相关性顺序为芦丁＞水仙苷＞烟花苷＞杨梅苷；木薯种质的不同采收期和不同成熟度叶片中黄酮醇分析表明，在多数木薯种质中，第270天采收的芦丁、烟花苷和水仙苷含量高于第180天，杨梅苷因品种而异；不同木薯种质（除SC09外）幼叶期的杨梅苷、芦丁和烟花苷含量均高于嫩叶期和成熟期；成熟期（除花叶木薯）水仙苷含量均高于幼叶期和嫩叶期。本研究结果可为木薯叶黄酮醇物质的开发利用（原料的选择、质量控制等方面）提供评价技术和依据，也为揭示木薯叶黄酮醇物质积累规律奠定基础。

关键词：木薯叶；黄酮醇；HPLC；采收时期；成熟度中图分类号：S533      文献标识码：A

Optimization of Detection Methods for Flavonols in Cassava Leaves

WANG Qinfei1， LIN Liming1， XUE Maofu1， ZHANG Jinquan2， YU Houmei1， ZHANG Zhenwen1*

1. Tropical Crops Genetic Resources Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / National R & D Centre for Potato Processing， Haikou， Hainan 571101， China; 2. College of Horticulture， Hunan Agricultural University， Changsha， Hunan 410000， China

Abstract： Cassava leaves are rich in abundant flavonols， and efficient extraction and analysis methods are crucial for the evaluation of flavonol content in the cassava leaves. This study aims to optimize the extraction and detection methods for four flavonols （myricetin， rutin， nicotiflorin， narcissoside） in cassava leaves and to analyze the influence of different

cassava varieties， harvesting periods， and maturity on the content of these flavonols. The results indicated that using a

50% ethanol-water solution， a liquid-to-material ratio of 1∶50 （g/mL）， an ultrasonic extraction temperature of 50 ℃，

and an ultrasonic extraction time of 60 minutes could effectively extract the four flavonols in the cassava leaves. The

combination of different C18 chromatographic columns in HPLC-DAD effectively separated the four flavonoids present in the cassava leaves. The results of the method validation showed that the four flavonols exhibited good linear correlations within a certain concentration range， with R2 values of 0.9999， 0.9999， 0.9999 and 0.9998， respectively. The detection limits ranged from 6.0 mg/kg to 10.0 mg/kg， and the quantification limits ranged from 20.0 mg/kg to 32.0 mg/kg. The detection method demonstrates good system adaptability， with retention time and peak area relative standard deviations （RSD） being less than 1%. The samples showed good stability in terms of intra-day， inter-day， and intra-month variations， with RSD in content variations ranging from 0.44% to 3.57%. The average recovery rates of the method ranged from 92.68% to 109.14%， all with RSD values less than 6.0%. Utilizing the established extraction and analysis methods， the study analyzed the content of the four flavonols in 30 cassava germplasm resources. Rutin and nicotiflorin maked up 93.50% to 99.30% of the total flavonol content in the cassava leaves， with the levels primarily determining the total flavonol content. However， the correlation order for the total flavonol content among different varieties was rutin>narcissoside>nicotiflorin>myricetin. Analysis of flavonol content in the cassava leaves from different harvest times and maturity levels of cassava germplasm revealed that in most cases， the levels of rutin， nicotiflorin and narcissoside were higher in the leaves harvested at 270 days compared to those harvested at 180 days， with myricetin varying by variety. Except for SC09， the levels of myricetin， rutin and nicotiflorin were higher in the young leaves compared to the tender and mature leaves in different cassava germplasms. The content of narcissoside in mature leaves （except for flower leaf cassava） was higher than that in young leaves and tender leaves. The results would provide an evaluation basis for the development and utilization of cassava flavonols in the selection of raw materials and quality control， and lay a foundation for revealing the accumulation rules of cassava flavonols.

Keywords： cassava leaves; flavonols; HPLC; harvest time; maturity

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2023.12.008

木薯（Manihot esculenta Crantz）屬热带和亚热带的块根作物，与甘薯、马铃薯并称为世界三大薯类，有“淀粉之王”和“能源作物”之美誉。木薯叶作为木薯采收后的主要副产物，占整个植株生物量的9%，因其富含蛋白质、矿物质、维生素，在撒哈拉以南的非洲国家和一些亚洲国家（印度尼西亚、菲律宾和马来西亚等）常作为蔬菜以补充营养，或被用于动物饲料[1-5]。全世界木薯产量达3.15亿t（2021年FAO统计数据），尽管许多国家广泛种植木薯，也很容易获得木薯叶，但因其具有高含量的氰化物而被丢弃或留在田间，这不仅浪费资源，且对环境造成严重污染。研究显示，木薯叶除含有人体必需的主要营养物质外，还富含黄酮类化合物[6]。自然界中黄酮类化合物常以不同的黄酮醇苷类化合物稳定存在于植物组织中，具有抗癌、抗炎、抗菌、抗氧化等作用，可用作营养保健品的膳食类黄酮的替代来源广泛应用于医学、保健品、食品等领域[7-10]。然而，提高植物类黄酮产量、稳定或增加食品加工过程中和营养保健品的黄酮含量仍是亟待解决的科学问题[11]。因此，选择富含黄酮类化合物的植物，开发高效、安全的提取方法，最大程度地获取植物类黄酮，是未来提高木薯叶等植物工业规模生产黄酮类化合物的主要因素[12]。目前，固-液萃取是应用最广泛的黄酮类化合物提取方法，但该方法使用大量溶剂、耗时长、效率低，由于长时间加热而导致能耗高[13-14]。新的提取技术，如超声辅助萃取（UAE）、微波辅助萃取（MAE）、酶辅助萃取（EAE）、高压萃取（HPE）和超临界流体萃取（SFE）提取天然活性物质具有提取率高、速度快，且不改变有效成分等优点，并在木薯次生代谢产物中得到广泛应用[12， 14-17]。研究者利用HPLC-MS、HPLC-DAD等色谱分析方法从木薯叶中鉴定到芦丁、烟花苷、槲皮素、山奈酚、杨梅苷、金丝桃苷、剌槐苷、水仙苷8种黄酮醇，其中，芦丁、烟花苷含量约占黄酮醇总量的99.0%以上[6]，但不同的木薯品种、生育期、采收期和种植环境均会影响其含量[18-19]，筛选获得高含量、稳定的黄酮醇类物质是提高木薯叶片利用价值的重要途径。本研究在课题组前期建立的分析方法基础上[19]，优化并建立木薯叶中主要的4种黄酮醇提取和定量分析方法，应用于不同的木薯品种、采收期、成熟度叶片中黄酮醇的分析评价，以期为木薯叶黄酮醇开发利用、原料的选择和质量控制等提供检测依据，为木薯叶的高值化利用提供技术支持。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  植物材料  木薯叶片采摘于海南儋州国家木薯种质资源圃，木薯于2022年3月种植，参试木薯种质见表1。

1.1.2  主要试剂  标准样品杨梅苷（杨梅素-3-O-芸香糖苷，myricitrin）、芦丁（槲皮素-3-O-芸香糖苷，rutin）、烟花苷（山奈酚-3-O-芸香糖苷，nicotiflorin）、水仙苷（异鼠李素-3-O-芸香糖苷， narcissoside），纯度≥98.0%，购自上海源叶生物发展有限公司。甲醇、乙腈为色谱纯，购自美国Sigma公司。无水乙醇、磷酸等为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；聚四氟乙烯（PTFE）微孔滤膜（0.22 μm），购自天津市津腾实验设备有限公司。

1.1.3  仪器设备  Agilent1260型液相色谱系统，配备自动进样器（型号：G1329B）、二极管阵列检测器（型号：G1315D）和柱温箱（型号：G1316A）。色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18（250 mm×4.6 mm， 5 μm）购自美国Agilent科技有限公司；超声波清洗器（型号：SB25- 12DT），购自宁波新芝生物有限公司；Elix3+ Synergy超纯水系统，购自美国Millipore公司。

1.2  方法

1.2.1  样品采集和制备  采摘种植后第180天嫩叶期的木薯叶片，考察不同种质木薯叶片黄酮含量的差异；分别在种植后第180天和第270天采摘木薯叶片，考察不同采收时期的黄酮醇含量差异；参考文献[20-21]的方法在木薯种植后第180天时采集叶片，采摘5～10株不同木薯种质的幼叶、嫩叶和成熟叶，考察不同成熟度木薯叶片4种黄酮醇含量的差异，其中，幼叶期为顶部向下1～4片未展开叶片，嫩叶期为顶部向下4～8片展开未木质化的叶片，成熟期为顶部向下8～12片展开未黄化的叶片；木薯叶片采集后，迅速用液氮速冻，装入洁净的密封袋中，冷冻密封避光保存于-80 ℃冰箱，待用。

1.2.2  黄酮醇提取方法的优化  参考文献[14， 19]对黄酮醇提取效率影响较大的因素乙醇浓度（20%、40%、50%、60%、80%、100%）、料液比（1∶10、1∶30、1∶50、1∶70、1∶90）进行优化，利用不同的提取量（0.2、0.5、1.0 g）和提取次数（1次、2次）验证其提取效果。对以上提取条件进行考察时，超声提取温度为50 ℃，提取时间为60 min。

1.2.3  木薯叶片中黄酮醇的提取  取适量的木薯叶片，加入液氮研磨后，准确称取研磨后的木薯叶粉0.2 g（精确至0.0001 g）于15 mL离心管中，加入50%乙醇水溶液5.0 mL，超声提取60 min（50 ℃， 500 W），混匀，离心10 min（4200 r/min， 25 ℃）；上清液转移至10 mL容量瓶中，残渣再加入5.0 mL 50%乙醇水溶液，旋涡振荡混匀，离心5 min（4200 r/min， 25 ℃），合并2次离心的上清液，加入50%乙醇溶液定容至10 mL，混匀即为待测液。取1.0 mL待测液，通过0.22 μm PTFE微孔滤膜，供高效液相色谱仪测定。

1.2.4  色谱条件优化  参考文献[16， 19]，对检测波长、流动相组成及洗脱程序、色谱柱等进行优化比较，确定其最佳的条件。最后，确定稳定性较好，价格偏低的Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18（250 mm×4.6 mm， 5 μm）色谱柱1进行样品分析。以甲醇（A）和0.2%磷酸水（B）溶液为流动相进行梯度洗脱，洗脱程序为：起始为25% A，75% B；15 min时A为58%，B为42%；20 min时A为80%，B为20%；25 min时A为100%，B为0；27 min时，A为25%，B为75%，平衡柱子5 min，进下一个样；流速为0.8 mL/min；检测波长为360 nm；进样量为10 μL；柱温为40 ℃。所有样品进样前经0.22 μm PTFE微孔滤膜过滤。采用外标法定量。

1.2.5  标准溶液的配制与标准曲线的制作  分别称取适量的杨梅苷、芦丁、烟花苷、水仙苷标准样品，用色谱甲醇配制成质量浓度分别为1.0、6.0、3.0、1.0 mg/mL的单标母液，保存于-18 ℃冰箱中，再用色谱甲醇依次稀释，配制成不同浓度的混合标准溶液，经0.22 μm PTFE微孔滤膜过滤后备用。将混合标准溶液进样分析，以峰面积（mV）为纵坐标（y），标准溶液浓度（mg/L）为横坐标（x），制作标准曲线并进行线性回归分析。

1.2.6  方法检出限和定量限测定  称取经液氮研磨后的木薯叶粉0.2 g（精确至0.0001 g），加入50%乙醇水溶液超声提取黄酮醇，离心后弃上清液，残渣反复洗脱3～5次，直到洗脱液上机检测不到4种黄酮醇，再在残渣中加入不同浓度的4种黄酮醇混合标准品溶液200.0 μL，用氮气吹干样品，使其标准溶液被样品吸收后，按1.2.2和1.2.3的提取和检测方法分析样品，并按样品中4种黄酮醇的峰高和仪器噪音的比值计算信噪比（S/N），分别以S/N>3和S/N>10的样品浓度确定方法的检出限和定量限，设置5个重复。

1.2.7  方法系统适应性评价  随机选择1个样品，重复进样6次，计算样品色谱图中杨梅苷、芦丁、烟花苷和水仙苷的保留时间、峰面积和拖尾因子变化的相对标准偏差（RSD），考察检测方法的重复性，以测试方法的系统适应性。

1.2.8  样品的日内、日间和月间稳定性试验  任意选择1个加标待测样品置于室温下，每隔4 h测定其响应值，计算样品中杨梅苷、芦丁、烟花苷和水仙苷含量变化的RSD值，考察样品在24 h的日内稳定性。任意选择1个加标待测样品在?18 ℃条件下避光放置，分别在提取后第1、10、20、30天对同一份样品进行测定，计算样品中杨梅苷、芦丁、烟花苷和水仙苷含量变化的RSD值，考察样品溶液冷冻条件下避光放置的月内稳定性。将木薯叶样品避光放置于?18 ℃条件下，分别在放置后第1、3、6、9、12个月，按1.2.2的方法提取样品中黄酮醇进行上机分析，计算样品中杨梅苷、芦丁、烟花苷和水仙苷含量变化的RSD值，考察不同保存时间样品中黄酮醇的稳定性。每个样品设置3个重复。

1.2.9  样品的加标回收试验  准确称取木薯叶粉0.2 g（精确至0.0001 g），根据考察样品浓度范围按高、中、低3个浓度水平加标，每个水平重复3次，按1.2.2提取4种黄酮醇类物质，进行回收率和準确度试验。以回归方程计算样品浓度，并计算样品平均回收率和相对标准偏差，以此评价方法的准确度。

1.3  数据处理

采用Microsoft Excel 2015软件进行数据统计，采用Origin 2021软件制图，采用IBM SPSS Statistics 22.0统计软件进行显著性、相关性和聚类分析；采用最小显著差数法（LSD）进行数据的多重比较。方法学验证参考《中国药典》2020版的分析方法验证指导原则开展试验。

2  结果与分析

2.1  提取方法的优化

研究表明，提取溶液和料液比是影响黄酮类物质提取效率的最大影响因素[6， 19， 22]。本研究采用超声波辅助提取法，对提取溶液乙醇比例和料液比进行优化，并考察样品量和提取次数对4种黄酮醇总含量的影响。结果表明，40%～60%乙醇浓度适合提取木薯叶中4种黄酮醇，在此范围内黄酮醇总含量无显著差异，在乙醇浓度为50%时黄酮醇提取含量达到最高（5832.5 mg/kg）；高乙醇浓度（80%～100%）不适合黄酮醇的提取（图1A）。以50%乙醇浓度，1∶10～1∶90（g/mL）料液比进行提取，发现料液比为1∶30、1∶50、1∶70进行提取时，4种黄酮醇总含量均未达到显著性差异，料液比为1∶50时，总黄酮醇含量达到6657.3 mg/kg（图1B）。以1∶50的料液比，对样品量和提取次数进行考察，发现样品量大小不影响4种黄酮醇的提取效果（图1C）；2次提取，可以增加4种黄酮醇含量，增加量分别为8.3、326.0、111.2、12.3 mg/kg，但增加量未达显著性差异（图1D）。试验确定了木薯叶中4种黄酮醇的提取方法为：提取溶液为50%乙醇水溶液，料液比为1∶50（g/mL），分2次加入提取溶液，在超声温度为50 ℃下提取60 min，可获得较好的提取效果。

2.2  检测波长的确定

在200～600 nm范围内对杨梅苷、蘆丁、烟花苷和水仙苷的混合标样溶液进行紫外扫描，4种黄酮醇物质在该波长范围内分别在260、360 nm左右有2个特征吸收高峰（表2），因此，选择4个黄酮醇最大吸收峰处360 nm为检测波长。

2.3  流动相的选择

黄酮醇的检测流动相主要用乙腈或甲醇和加酸（磷酸、乙酸等）的水溶液进行梯度洗脱，参不同大写字母表示差异极显著（P<0.01）；不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。

考文献[16-17]的方法，比较了乙腈∶0.25%乙酸溶液（图2A）和甲醇∶0.2%磷酸溶液（图2B）2种流动相配比对4种黄酮醇混合标准品分离效果的影响，分析发现，磷酸水溶液更适合分析4种黄酮醇，乙腈∶0.25%乙酸溶液不能有效地分离烟花苷和水仙苷。

2.4  流动相的梯度洗脱程序优化

为了获得样品中4种黄酮醇的最佳分离效果，参考文献[19]的方法，对流动相梯度程序进行了优化，发现甲醇∶0.2%磷酸溶液的起始流动相比例为25%时洗脱分析样品，杨梅苷的干扰峰可以完全分离（图3A），而起始流动相比例为40%洗脱时，虽然可以缩短样品的洗脱时间，但有干扰峰影响杨梅苷的积分（图3B），通过比较分离效果，确定木薯叶中4种黄酮醇的洗脱程序（见1.2.3）。

2.5  色谱柱的选择

在进行黄酮类物质进行分析的过程中，研究者多采用C18色谱柱，但不同品牌和填料修饰其分离效果有差异，利用优化后的流动相比例（甲醇∶0.2%磷酸溶液），比较了3个品牌色谱柱的分析效果[色谱柱1：Agilent ZORBAX Eclipse XDB- C18 （Analytical 4.6 mm×250 mm， 5μm）；色谱柱2：Waters Atlantis? C18 （150 mm×4.6 mm， 5 μm）；色谱柱3：Merk Purospher? STAR RP-18e （Hibar? 150 mm×4.6 mm， 5 μm]，发现3个品牌的色谱柱均可以有效分离4种黄酮醇类化合物（图4）。结果表明，C18柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm）或性能相当的色谱柱均能有效分离木薯叶中杨梅苷、芦丁、烟花苷和水仙苷4种黄酮醇类物质。

2.6  方法学考察

2.6.1  线性关系考察  以不同梯度的标准品检测峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，由峰面积（y）对溶液浓度（x）作线性回归方程，并得出相关系数（R2）。如表3所示，杨梅苷、芦丁、烟花苷和水仙苷在浓度范围内呈良好的线性关系，R2均大于0.9998。

2.6.2  方法检出限和定量限  通过空白样品加标法，加入低浓度标准样品进入洗脱的样品中，考察方法的检出限和定量限。结果显示，木薯叶中杨梅苷、芦丁、烟花苷和水仙苷4种黄酮醇的检出限分别为10.0、10.0、6.0、6.0 mg/kg，木薯叶中4种黄酮醇的定量限分别为32.0、27.0、20.0、20.0 mg/kg（表4）。

2.6.3  方法系统适应性评价  以杨梅苷、芦丁、烟花苷和水仙苷4种黄酮醇浓度分别为50、300、150、50 mg/L的标准溶液连续进样6次，考察方法的重复性和峰拖尾情况，以此评价方法系统适应性。由表5可知，保留时间和峰面积变化的RSD均小于1%，峰的拖尾因子在1.12～1.19之间，证明方法的重复性较好，色谱峰形较好。

2.6.4  样品的日内、日间和月间稳定性试验  在24 h内，每隔4 h测定加标待测样品中4种黄酮

醇含量，4种黄酮醇含量变化的RSD在0.44%～ 1.04%之间，表明样品在常温条件下放置，日内（24 h）稳定性较好。将待测加标样品溶液避光置于?18 ℃条件下，分别在提取后第1、10、20、30天对同一份样品进行测定，4种黄酮醇30 d内含量变化的RSD在1.45%～3.57%之间，证明提取样品在冷冻条件下避光放置30 d内，样品稳定性较好。将样品避光置于?18 ℃条件下，分别在保存1、3、6、9、12个月，提取样品中黄酮醇上机分析，4种黄酮醇含量变化的RSD在1.37%～3.31%之间，证明样品在?18 ℃冰箱中保存12个月，样品中的黄酮醇含量稳定性较好（表6）。

2.6.5  方法回收率和准确度  以样品加标法，通过低、中、高3个浓度进行加标试验，结果显示，加标回收浓度变化的RSD≤5.31%，杨梅苷平均回收率在94.71%～97.81%之间；芦丁平均回收率96.78%～102.21%之间；烟花苷平均回收率为92.68%～100.07%；水仙苷平均回收率为93.69%～109.14%；RSD均小于6.00%，加标回收结果证明该方法的准确度较高，重复性较好，可用于实际样品的测定（表7）。

2.6.6  不同品种、采收期和成熟度对木薯叶中黄酮醇含量的影响  利用建立的提取方法和检测方法，对不同品种、不同成熟度和不同采收期木薯叶中的4种黄酮醇进行考察。对比王定美等[18]的研究结果，本研究中种植180 d的木薯叶黄酮含量较好，因此，采摘30个木薯种质种植180 d时嫩叶期木薯叶片进行4种黄酮醇含量分析（图5）。结果表明，30个木薯种质叶片中的杨梅苷、芦丁、烟花苷和水仙苷含量分别在0～554.62、1190.26～ 8852.21、312.06～3691.51、50.87～283.25 mg/kg之间，品种间黄酮醇含量差异较大，芦丁和烟花苷含量占4种黄酮醇总量的93.5%～99.3%，這与CHAHYADI等[14]的结果一致。4种黄酮醇含量较高的品种为SC11、紫叶木薯和KU50。

30个木薯种质叶片中4种黄酮醇相关分析表明（表8），不同种质间4种黄酮醇含量的相关性达显著或极显著，其中，芦丁、水仙苷与总黄酮含量相关性较高，相关系数分别为0.967、0.915，烟花苷、杨梅苷与总黄酮含量的相关系数分别为0.782、0.693。虽然芦丁和烟花苷含量占总黄酮醇含量的93.5%～99.3%，但不同种质间水仙苷含量也与总黄酮醇含量相关系数较高，同样可作为判定总黄酮含量高低的指标。

进一步对30份木薯种质进行系统聚类分析，聚类距离采用欧式距离平方法，聚类方法采用组间联接法，根据不同种质类间距离进行区分，得到不同种质聚类树状图（图6）。欧式距离超过5时可分为3类，即第一类为SC11、紫叶木薯、KU50三个芦丁和烟花苷含量相对较高的种质；第二类为花叶木薯、SC09、SC124等芦丁、水仙苷含量相对较高的种质；第三类为SC205、GR911、糖木薯4种黄酮醇含量相对较低的种质，大部分种质集中在第二类。

根据聚类分析结果，选择3类7个木薯种质在种植后第180天和第270天采摘叶片，分析不同采收时期4种黄酮醇含量的差异（图7）。结果表明，第270天采收时多数种质叶片中的芦丁、烟花苷和水仙苷含量高于第180天，第270天采收的第一类种质（紫叶木薯和SC11）中黄酮醇含量均高于第二类和第三类；在第180天采收时，第二类和第三类部分种质（如SC9、印尼细叶、SC205）的杨梅苷含量显著高于第270天采收的，但芦丁占黄酮醇总含量的90%，表明不同采收时期种质间黄酮醇总含量高低由芦丁含量决定。因此，可选择不同种植时间采收木薯叶，以获得相对含量较高的黄酮醇目标物质。

通过分析种植180 d不同成熟度木薯叶中4种黄酮醇含量（图8）结果表明，不同木薯种质中，除SC9种质幼叶期的杨梅苷含量略低于嫩叶期和老叶期外，其他6个木薯种质幼叶期的杨梅苷、芦丁和烟花苷含量均高于嫩叶期和成熟叶，而前期研究发现嫩叶期芦丁和烟花苷含量较高[19]，这可能与采收时间和考察品种有关，如SC9嫩叶期和幼叶期的芦丁和烟花苷含量无显著差异。除花叶木薯外，其余种质成熟叶中的水仙苷含量均高于幼叶期和嫩叶期。考察的3类7个种质中，杨梅苷、芦丁和烟花苷含量在幼叶期或嫩叶期较高，水仙苷在成熟叶中含量较高。

3  讨论  

黄酮类化合物的提取多采用醇提或水提的方法[13， 23-24]，木薯叶中黄酮类化合物较多，研究显示，木薯叶中主要的黄酮醇化合物为芦丁和烟花苷[6]，前期研究者主要根据化合物组成选择提取方法，并证明乙醇溶液超声辅助方法可以有效提取芦丁[24]。课题组前期试验结果[19]也表明，乙醇浓度和料液比会影响黄酮醇的提取率，以40%和80%乙醇水溶液分步提取可以有效获得木薯叶中芦丁、烟花苷、槲皮素、山柰酚4种黄酮醇，其中槲皮素和山奈酚并不是木薯叶中的主要黄酮醇化合物。本研究通过优化乙醇浓度和料液比，明确了利用40%～60%乙醇溶液均可有效提取4种黄酮醇（芦丁、烟花苷、水仙苷和杨梅苷），但由于关注的主要黄酮醇化合物不同，料液比与前期结果[19]存在差异，其超声温度和时间对其提取效果并无显著影响，这与CHAHYADI等[14]的研究结果一致。因此，选择4种黄酮醇总含量提取率较高的50%乙醇水溶液，料液比1∶50（g/mL）进行后续试验。同时，试验也证实醇提可以提高黄酮醇化合物的提取效率，在适宜料液比的前提下，提取效率不受样品量和提取次数的影响。通过对检测波长进行扫描，对流动相比例和系统程序、色谱柱的选择进行了优化，建立了木薯叶中黄酮醇的HPLC分析方法。多数黄酮醇在280 nm和360 nm左右会有2个吸收峰，从吸收波长扫描显示，360 nm左右是黄酮醇的最大吸收峰。有研究表明，多数类黄酮物质在280 nm有最大吸收峰[25]，为避免部分黄酮类物质对黄酮醇检测的干扰，选择360 nm波长更有利于黄酮醇的检测。甲醇-磷酸水溶液和乙腈-乙酸水溶液流动相系统一直是分析类黄酮物质的最佳选择[23]，但在分析过程中发现，乙腈-乙酸水溶液作为流动相更适合分析黄酮类物质；甲醇-磷酸水流动相经过优化，在进行黄酮醇类物质分析过程中，能避免其他黄酮化合物的干扰，并完全分离黄酮醇物质；另外，C18色谱柱是分析黄酮类化合物常用的色谱柱类型，但不同品牌的C18色谱柱价格不同，通过比较发现，考察的C18色谱柱均可以有效分离木薯叶中的4种黄酮醇，选择合适的色谱柱可为后期大量样品的分离和定量分析节约成本。

参考《中国药典》（2020版）分析方法验证指导原则进行方法学验证，结果表明，建立的检测方法线性相关性较好，R2均在0.9998以上；检测限和定量限分别在6.0～10.0 mg/kg和20.0～ 32.0 mg/kg之间；检测方法系统适应性也较好，回收率较高，完全可用于实际样品的测定，并发现样品中黄酮醇在不同的样品状态下日内、日间和月间稳定性较好，这为后期样品的保存提供了参考。利用建立的提取和检测方法，分析了30个木薯种质中4种黄酮醇含量，种质间黄酮醇总含量差异较大，芦丁和烟花苷含量占4种黄酮醇总量的93.5%～99.3%，这与TAO等[6]的研究结果一致；而王定美等[18]、詹春莲等[25]的研究认为，木薯叶中主要的黄酮物质是芦丁、二氢黄酮醇和穗花杉双黄酮，在质谱定性检测过程中也发现了2种含量较高的双黄酮化合物，通过光谱和色谱图比较发现，王定美等[18]在检测中并未对烟花苷进行定量分析，詹春莲等[25]在进行木薯叶类黄酮指纹图谱建立过程中，仅考察了270 nm波长下的色谱峰，而本研究中烟花苷的紫外最大吸收峰在350 nm处，由此导致了结果差异。虽然黄酮醇总含量由芦丁和烟花苷决定，但相关性分析表明，种质间黄酮醇总含量高低的相关性顺序为芦丁>水仙苷>烟花苷>杨梅苷；选择聚类分析对3类7个木薯种质不同采收期和不同成熟度叶片进行分析表明，在多数木薯种质中第270天时采收的叶片中芦丁、烟花苷和水仙苷含量高于第180天采收的，少部分种质的叶片第270天时采收杨梅苷含量高于第180天；但不同木薯种质（除SC09外）幼叶期的杨梅苷、芦丁和烟花苷含量均高于嫩叶期和成熟期；成熟期水仙苷含量（除花叶木薯外）均高于幼叶期和嫩叶期。研究表明，黄酮醇作为次生代谢产物可通过与生长素、细胞分裂素和活性氧共同调控植物向光性生长及发育，槲皮素和山奈酚（或其衍生物）等黄酮醇很可能通过限制分生区细胞分化，加速细胞伸长进而调控植物组织的生长，幼叶和嫩叶期细胞分裂旺盛，并且不同的黄酮醇合酶基因调控着不同的黄酮醇积累[26-28]，芦丁和烟花苷分别是槲皮素和山奈酚糖苷类代谢物，因此，在幼叶期或嫩叶期积累较多。各种黄酮醇物质在植物不同组织、不同发育阶段以及不同环境条件下扮演的精细角色，激素和环境因子均影响其合成[29]。但木薯叶中黄酮醇是否受植物激素等协同调控、黄酮醇合酶基因的调控，各种黄酮醇合成的机制揭示等问题仍有待于进一步深入探讨。

总之，建立高效的提取和分析方法是了解木薯叶片中黄酮醇化合物组成和含量的基础，木薯叶中黄酮醇含量受品种、采收期和成熟度的共同影响，为获得高含量黄酮醇植物源，开发利用好木薯叶中黄酮醇物质，进一步研究木薯叶中黄酮醇合酶基因的调控机制，有助于更深入地了解4种黄酮醇积累与木薯品种、采收期和成熟度的关系，为揭示木薯叶中黄酮醇物质积累规律奠定基础。

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