木薯MePP2CAb基因克隆及表达分析

王舒婷 杨静琳 林墁 李丽珍 刘博婷 吴春来 曾坚 胡伟

摘  要：2C型蛋白磷酸酶（protein phosphatase 2C， PP2C）在ABA核心信號途径中发挥着重要作用。为了研究PP2C基因在木薯响应非生物胁迫过程中的功能，本研究通过RT-PCR技术，从木薯Arg7中克隆得到MePP2CAb基因，并对其进行生物信息学分析、自激活活性分析、启动子活性分析及不同逆境和激素处理下的表达模式分析。结果表明：（1）MePP2CAb基因的长度为1296 bp，包含431个氨基酸残基，蛋白相对分子量和理论等电点分别为47.08 kDa和5.5，具有PP2C家族的结构域特征。蛋白质序列比对结果显示，MePP2CAb与橡胶树和麻风树的PP2C序列最为相似，一致性分别为82.75%和74.01%，在C-端保守。上述结果证明MePP2CAb基因属于PP2C家族。（2）MePP2CAb基因在木薯块根中的表达最高。（3）MePP2CAb具有一定的自激活活性，MePP2CAb基因的全长启动子的活性也较高。（4）MePP2CAb基因属于ABA核心通路，启动子序列分析显示，它包含ABRE（abscisic acid responsiveness）元件、MeJA响应原件、干旱诱导元件（drought-induced motif）等元件。不同逆境和激素处理的结果也表明，MePP2CAb基因在冷处理和SA处理下受到抑制，在NaCl、mannitiol、ABA和MeJA处理的过程中受到诱导。另外酵母双杂交结果显示MePP2CAb能够与MePYL1产生互作。根据上述结果推测，MePP2CAb基因可能对木薯的非生物胁迫有响应，但其到底是正调控因子还是负调控因子尚不清楚。该结果为进一步研究解析MePP2CAb基因在ABA信号通路中的作用及提高木薯在非生物胁迫中的适应能力提供参考。

关键词：木薯；ABA；PP2C；非生物胁迫中图分类号：S533      文献标识码：A

Cloning and Expression Analysis of MePP2CAb Gene in Cassava

WANG Shuting1， YANG Jinglin1， LIN Man1， LI Lizhen1， LIU Boting1， WU Chunlai2， ZENG Jian1*， HU Wei2

1. Guangdong Provincial Key Laboratory of Utilization and Conservation of Food and Medicinal Resources in Northern Region / Henry Fok School of Biology and Agriculture， Shaoguan University， Shaoguan， Guangdong 512005， China; 2. Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Science， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract： Protein phosphatase 2C （PP2C） plays a key role in the ABA signaling pathway. In order to investigate the response process of the PP2C gene to abiotic stress in cassava， MePP2CAb gene was cloned from Arg7 in cassava using the RT-PCR technique. Bioinformatic analysis， autoactivation activity analysis， promoter activity analysis， and expression pattern analysis of the MePP2CAb gene under different stress and hormone treatments were conducted. The results showed that （1） the total length of the MePP2CAb gene was 1296 bp， encoding 431 amino acid residues. The MePP2CAb protein had a relative molecular weight of 47.08 kDa and a theoretical isoelectric point of 5.5. It exhibited structural domain characteristics of the PP2C family. Protein sequence analysis showed that MePP2CAb was most similar to PP2C sequences of Hevea rubber and Jatropha jatropha， with consistencies of 82.75% and 74.01%， respectively， and a conserved C-terminal. These results indicated that MePP2CAb belongs to the PP2C family. （2） The expression of the MePP2CAb gene was found to be higher in cassava storage roots， stems， and leaves， with the highest expression observed in storage roots. （3） MePP2CAb demonstrated self-activation activity， and its full-length promoter exhibited high activity. （4） The MePP2CAb gene belongs to the core ABA pathway， and promoter sequence analysis showed that it contained ABRE （abscisic acid responsiveness） elements， MeJA response elements， and a drought-induced motif. Under different stress and hormone treatments， low temperature and SA treatment significantly repressed the MePP2CAb gene， while mannitol， NaCl， ABA， and MeJA significantly induced its expression. In addition， the interaction between MePP2CAb and MePYL1 was also observed. These results suggest that MePP2CAb may be responsive to abiotic stress in cassava， although its role as a positive or negative regulatory factor remains unclear. These results provide a clue for further investigation into the role of the MePP2CAb gene in the ABA signaling pathway and the improvement of cassava's adaptation to abiotic stress.

Keywords： cassava; ABA; PP2C; abiotic stress

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2023.12.004

脱落酸（abscisic acid， ABA）在植物的种子萌发、生长、开花和果实成熟等过程中发挥重要作用，并且也参与植物对非生物和生物胁迫等逆境响应[1-5]。2009年，科学家们在拟南芥中阐明了ABA信号转导的核心通路，包括ABA受体PYR/PYL/RCARs、A类蛋白磷酸酶2Cs以及蛋白激酶SnRK2s[6]。

干旱是对农业生产产生重要影響的因素之一，它会对作物的生长产生影响，从轻微的产量下降到严重的作物绝收[7-8]。植物对非生物胁迫的响应主要通过激素实现，其中ABA是应对干旱胁迫的重要激素[9]。当遭受干旱胁迫时，植物体内的ABA含量增加，而ABA的增加会影响许多基因的表达，包括ABA依赖途径和非依赖途径，其中ABREs是ABA依赖途径中的关键反应元件[10-12]。研究表明，ABA信号传导途径中的PP2C A亚家族成员通常作为负调节因子[6， 13]，该基因家族已在水稻、拟南芥、玉米、油菜和棉花等物种中被鉴定出来[14-18]。拟南芥的PP2C A亚家族基因突变体abi1/abi2/hab1/pp2ca会负调控ABA信号[19-22]。此外，在拟南芥中过表达玉米ZmPP2C、ZmPP2c-A10基因和杨树PP2C基因也可负调控ABA信号，从而降低转基因拟南芥对高盐和干旱胁迫的耐受性[23-25]。

木薯（Manihot esculenta Crantz）是一种重要的粮食作物，在热带和亚热带地区广泛种植，被全球公认为第六大粮食作物，为近10亿人提供碳水化合物[26-27]。木薯具备抗旱特性，因此可作为研究抗旱机制的典型材料[28]。目前，关于木薯中PP2C基因家族的研究还非常有限[29]。因此，为了深入研究PP2C基因在木薯抗逆过程中的功能，本研究克隆了MePP2CAb基因，对其编码蛋白序列进行生物信息学分析。同时研究MePP2CAb基因的启动子活性以及与ABA信号通路的上游成员MePYLs之间的相互作用。并分析MePP2CAb基因在不同逆境胁迫和激素处理下的表达模式，为深入研究MePP2CAb基因的功能提供参考依据。

1  材料与方法

1.1  材料

木薯品种Arg7由中国热带农业科学院热带生物技术研究所提供。木薯Arg7通过茎秆插条进行繁殖，取生长期为60 d且长势一致的Arg7幼苗，分别进行不同处理。激素处理：分别使用100 μmol/L ABA、100 μmol/L SA、100 μmol/L MeJA进行喷施处理，并在处理后的0、2、6、12、24 h时间点采集叶片样品；逆境处理：分别使用300 mmol/L NaCl和200 mmol/L mannitol进行浇灌处理，并在处理后的0、2、6 h和3、14 d时间点采集叶片样品。4 ℃处理后分别在0、2、6、12、48 h时间点取叶片样品。将取得的叶片样品迅速置入液氮中冷却，并保存在?80 ℃的冰箱中备用。

主要试剂：DNA回收纯化试剂盒、质粒提取试剂盒、pMD18-T载体、荧光定量PCR反应试剂、反转录试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，感受态细胞（农杆菌GV3101和大肠杆菌DH5α）购自诺唯赞生物科技有限公司，2?Taq Master Mix酶、Nimble Clonig克隆试剂盒和T4连接酶购买自海南壹田生物科技有限公司，限制性核酸内切酶购买自Thermo Fisher Scientific。pGBKT7和pGreenII 0800-LUC表达载体保存在本课题组实验室。仪器设备：PCR仪（耶拿，德国），EPS300电泳仪（Tanon，上海），4100凝胶成像仪（Tanon，上海），MX3000荧光定量PCR仪（安捷伦，美国），超微量紫外分光光度计（Thermo，美国），CT15RT高速冷冻离心机（TECHCOMP，中国）。

1.2  方法

1.2.1  启动子的活性分析  采用农杆菌转化法将载体pGreen1I 0800-LUC-MePP2CAb转化至GV3101感受态细胞，获得阳性转化子后，调整菌体的OD600至1.0，使用1 mL注射器，将其注射至生长2个月左右的烟草嫩叶叶片下表皮，注射后培养3 d，随后测定双荧光素酶含量，进行LUC/REN计算（6个重复）。

1.2.2  生物信息学分析  通过ExPASy ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）在线软件分析基因编码蛋白的理化性质，结构预测使用SOPMA软件和SWISS-MODEL（https：//swissmodel. expasy. org/）在线软件，使用BLASTP（https：//blast. ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）和MEGA-5软件进行搜索和同源序列比对，Neighbor-joining法构建系统发育树（Bootstrap值设定为1000）。

1.2.3  基因表达分析  根据MePP2CAb序列设计荧光定量引物（表1），并选择木薯MeTUB基因作为内参基因，使用qRT-PCR技术对不同处理下的MePP2CAb基因表达模式进行分析（3次生物学重复）。相对表达量的计算采用2?ΔΔCT法[26]。

1.2.4  酵母双杂交  首先进行自激活分析，使用PEG诱导方法，将载体pGBKT7-MePP2CAb转化到酵母中，取200 μL涂板至一缺培养基（SD/- Trp），在29 ℃培养48～96 h，从SD/-Trp培养基上挑取长势较好的单菌落，使用PCR法验证阳性转化子，用液体SD/-Trp培养基活化阳性转化子菌落，用ddH2O稀释至合适浓度，取2 μL菌落水溶液分别点到SD/-Trp、SD/-His和SD/-His/ +x-a-gal培养基上，于29 ℃培养，观察生长状况。根据相关基因的上下游互作关系，它们被分别构建到pGADT7和pGBKT7载体中，并提取阳性重组克隆菌液的质粒。以pGADT7-T和pGBKT7-53作为阳性对照，pGADT7-T和pGBKT7-Lam作为阴性对照，将阳性对照质粒组合、阴性对照质粒组合以及构建的重组质粒组合两两转化到AH109酵母感受态中培养观察基因编码蛋白的互作情况。挑取二缺培养基（LT/-Trp/-Leu）上的长势较好的单菌落，使用PCR法验证阳性转化子；用液体（LT/-Trp/-Leu）培养基活化阳性转化子菌落，挑取原始菌落，然后按梯度稀释，即1和10?1；吸取菌落水溶液2 ?L，分别点到二缺和四缺培养基（LTAH/-Trp/-Leu/-Ade/-His）上，于29 ℃培养，观察生长状况。

2  结果与分析

2.1  MePP2CAb基因克隆

在鉴定木薯的PP2C A亚基因家族时，课题组发现其中1个基因序列Manes.07G119400显著受到ABA和PEG处理的诱导（图1）。基于该序列，

设计引物并成功扩增出1个1296 bp的片段（图2）。测序结果显示，该序列编码的氨基酸残基数量为431，命名为MePP2CAb基因。MePP2CAb蛋白的分子式为C2004H3254N596O657S27，相对分子量为47.08 kDa，理论等电点为5.5，不稳定系数（46.66）显示它为不稳定蛋白。根据木薯基因组序列，MePP2CAb基因包含4个外显子和3个内含子。二级结构预测显示，MePP2CAb蛋白的无规则卷曲占比42.92%，α-螺旋占比37.12%，延伸链占比13.23%，β-转角占比6.73%。保守结构域预测显示，MePP2CAb蛋白含有PP2C家族结构域（图3）。以上预测结果表明MePP2CAb基因属于PP2C基因家族的成员。

2.2  MePP2CAb蛋白的序列比对和系统发育分析

通过在NCBI数据库中使用blastp方法，本研究获得了与MePP2CAb蛋白序列相似性较高（>65%）的其他PP2C基因的蛋白序列。蛋白序列比对结果显示，与MePP2CAb的一致性最高的是橡胶树中的PP2C基因（XP_021656015.1），达到82.75%，其次是麻疯树（XP_012088646.1），一致性为74.01%。MePP2CAb蛋白序列与其他PP2C基因蛋白序列具有较高的保守性，尤其是在C端（图4）。进化分析结果进一步证实，MePP2CAb与HbPP2C24处于同一分支（图5），木薯和橡胶树均属于大戟科植物，进一步证明PP2C蛋白氨基酸序列具有高度保守性。

2.3  MePP2CAb基因的表达分析

为了分析MePP2CAb基因在木薯不同组织中的表达水平，本研究对木薯的根、茎、叶等3种组织中MePP2CAb基因的表达模式进行分析。如图6所示，MePP2CAb基因在叶和茎中的表达量相似，而在根中的表达量最高。

其次，对MePP2CAb基因在不同胁迫和激素处理下的表达情况进行分析。在NaCl处理下，MePP2CAb基因的表达量先增加，在6 h达到最高水平后逐渐降低（图7A）；在mannitiol处理下，MePP2CAb基因的表达量在2 h时达到最高水平（图7B）；而在冷处理下，MePP2CAb基因的表达量受到抑制（图7C）。在MeJA处理下，MePP2CAb基因的表达量随着处理时间的增加先增加，在6 h达到最高水平后逐渐降低（图7D）；在ABA处理下，MePP2CAb基因的表达量在24 h达到最高水平（图7E）；然而，在SA处理下，MePP2CAb基因的表达量在所有处理时间点均被抑制（图7F）。以上结果表明，MePP2CAb基因在冷处理和SA处理下受到抑制，在NaCl、

2.4  MePP2CAb基因启动子的活性分析

MePP2CAb基因的启动子序列分析结果显示（PlantCARE数据库），该启动子包含5个ABRE顺式调控元件、3个MeJA响应元件和1个干旱诱导元件（图8A）。为了评估MePP2CAb基因启动子的活性，本研究将MePP2CAb基因的启动子构建到pGreenII 0800-LUC载体上，即pGreenII 0800-LUC- MePP2CAb（?1500～0）。通过农杆菌介导的遗传转化方法，将该载体瞬时转化到烟草叶片中，并使用双荧光素酶测定试剂盒测定MePP2CAb 基因启动子活性。结果显示，MePP2CAb基因的全长启动子具有较高的活性（图8B）。

2.5  酵母双杂交互作初步验证MePP2CAb基因参与ABA信号通路

为了验证MePP2CAb是否具有自激活能力，本研究将其构建到pGBKT7载体上，并进行验证。结果如图8C所示，pGBKT7-MePP2CAb在一缺培養基（SD/-Trp和SD/-His）上正常生长，并在SD/-His/x-a-gal培养基上呈现出蓝色。结果表明，MePP2CAb具有一定的自激活活性。因此，后续的酵母双杂实验需将其构建至pGADT7载体。

在ABA信號转导途径中，PYLs位于PP2C A亚家族的上游，为了证明MePP2CAb参与ABA信号通路，本研究克隆了MePYL1～MePYL4基因，并将其连接至pGBKT7载体上。通过验证PYLs与PP2C A之间的相互作用关系，结果如图8D所示，所有组合在二缺培养基上都能正常生长；在四缺培养基上，MePP2CAb+MePYL1和pGADT7-T+pGBKT7-53阳性对照有菌落形成；而MePP2CAb+MePYL2 / MePYL3 / MePYL4组合及pGADT7-T+pGBKT7-Lam阴性对照则没有菌落形成。初步推测MePP2CAb与ABA信号通路上游成分MePYL1存在相互作用关系。

3  讨论

UMEZAWA等[6]在拟南芥中首次确认了ABA受体及其核心信号转导通路，包括PYR/PYL/ RCARs（ABA受体）、A类PP2Cs（蛋白磷酸酶）和SnRK2s（蛋白激酶）。ABA作为植物响应非生物胁迫的关键激素，使得研究A类PP2Cs基因的功能显得十分重要。

3.1  MePP2CAb基因的结构与亲缘关系

本研究成功克隆了PP2C A亚家族成员MePP2CAb基因，其位于木薯7号染色体上，并包含4个外显子。通过与多个物种中PP2C的氨基酸序列比对分析，发现MePP2CAb基因在C端具有保守性[9]。此外，MePP2CAb与HbPP2C和JcPP2C在亲缘关系上较为接近，进一步证明MePP2CAb属于PP2C家族基因。

3.2  MePP2CAb基因在木薯不同组织中的表达模式

木薯作为热区的重要粮食和经济作物，具有耐贫瘠和抗旱的特性。ABA在植物应对非生物逆境的过程中扮演着重要角色，而PP2C则是ABA信号转导通路的核心组成成分[6]。MePP2CAb基因在Agr7的根、茎和叶中的表达水平都较高，其中根中的表达水平最高，这表明MePP2CAb基因可能参与根的生长发育。有研究显示，TaPP2C-a10和AanPP2C1基因分别在小麦和青蒿的不同组织中均有表达[30-31]。

3.3  A类PP2C基因的功能研究

已有研究表明，在拟南芥中的A类PP2C基因通常扮演负调控ABA信号的角色，其中一些基因参与氧化胁迫的响应，而AHG3参与抗冷胁迫[32-34]。玉米中的ZmPP2CA负调控干旱，而ZmPP2C2则可增强植物的抗寒能力[23-24]。此外，水稻中的A类PP2C基因也能响应多种非生物逆境[15]。本研究结果显示，MePP2CAb基因可被mannitiol、NaCl、ABA和MeJA诱导，但受SA和低温抑制。在拟南芥中，A类PP2C家族基因通常被视为ABA信号途径的负调控因子，但过表达FsPP2C2和AtPP2CG1基因可增强植株对逆境胁迫的耐受能力和对ABA信号的敏感性[35-36]。上述研究揭示了A类PP2C基因在不同植物和不同逆境条件下的功能差异。通常情况下，ABA主要在植物体内的根部和受胁迫的叶片中合成。然而，在本研究中，研究人员仅选择了叶片样品来检测MePP2CAb基因的表达量，而忽略了其在根部高表达的情况，这种方法可能会限制对MePP2CAb基因在不同处理条件下表达模式的全面理解。为了更好地解释研究结果，后续研究将对根部中MePP2CAb基因在不同处理条件下的表达模式进行分析。通过进行全面表达模式分析，可以更全面地了解MePP2CAb基因在逆境处理中的响应，有助于揭示MePP2CAb基因在植物逆境响应中的具体作用，并提供更准确解释相关现象的线索。酵母双杂交实验观察到MePP2CAb与MePYL1蛋白存在互作，进一步证明MePP2CAb属于PP2C A亚家族并参与ABA信号转导，推测MePP2CAb基因可能通过ABA信号通路响应非生物胁迫，但其具体是正调控因子还是负调控因子尚不明确。该研究结果为进一步研究MePP2CAb基因在ABA信号通路中的作用及提高木薯在非生物胁迫中的适应能力提供参考。

致谢  感谢李丹丹女士在论文撰写过程中的校对工作。

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