菌根真菌对干旱胁迫下建兰生理生化、根系脂肪酸组成及水分利用的影响

肖晓梅， 丁 玲

(福建农业职业技术学院园艺园林学院，福建福州 350000)

细胞膜是参与细胞呼吸、光合作用和信号转导等生理过程的半透性膜[6]，细胞膜的完整性和功能受脂质组成和脂肪酸(FAs)饱和度的影响。在生物体中膜脂中的FAs主要分为饱和脂肪酸(SFA)和不饱和脂肪酸(UFA)。目前的研究表明，FAs饱和度的特征、组成及变化与植物应对胁迫的策略密切相关[7]。先前的研究表明，干旱胁迫下不同狗牙根草(CynodondactylonL.)的FAs特征变化不同，在耐旱品种中UFA含量波动较小，在敏感品种中UFA总量降低[8]；进一步研究发现敏感型狗牙根草中主要表现为亚油酸(C18：2)和亚麻酸(C18：3)减少，棕榈酸(C16：0)和硬脂酸(C18：0)增加[9]。与此相反，在干旱环境中葡萄(Vitisvinifera)苗中以亚油酸(C18：2)为主的UFA含量增加，而以山嵛酸(C22：0)为主的SFA整体降低[10]。以上研究表明，干旱胁迫下植物可通过调节FAs的组成特征以维持生物膜的完整性。

建兰(Cymbidiumensifolium)为兰科(Orchidaceae)兰属(Cymbidium)多年生观赏性草本植物，建兰以其花姿优美、叶艺俱佳、兰香馥郁等特点深受人们喜爱[11]。然而在室内栽培或野外自然生长过程中易受到干旱和地表高温等影响，且建兰对干旱环境极为敏感，当水分长期供应不足时植株色泽暗淡甚至焦枯。兰科菌根(ORM)是兰科原球茎或成年植株根部与特定菌根真菌形成的一种共生结构[12]，绝大部分兰科植物必须通过ORM获取养分资源才能正常生长；目前，发掘菌根真菌应用于兰花栽培已成为最具应用前景的技术策略之一。本研究基于前期从建兰根系分离得到的3种不同属兰科菌根真菌，且研究表明该3株菌株对建兰(C.ensifolium)、硬叶兰(C.mannii)和铁皮石斛(Dendrobiumofficinale)生长具有良好的促进作用，但对于胁迫条件下兰科的促生效果尚不清楚[11]；基于此，探索了菌根真菌对干旱胁迫下建兰生理生化及脂肪酸组成的影响。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验于2021年6—10月在福建农业职业技术学院园艺实验室中进行。供试建兰(Cymbidiumensifolium)品种为小桃红，为标准的5 cm组培苗，来自福建农林大学兰科植物保护与利用重点试验室。3株兰科菌根真菌分别为胶膜菌(Tulasnellasp.)、角担菌(Ceratobasidiumsp.)和蜡壳菌(Sebacinasp.)，均分离自建兰根系，3株菌根真菌具体信息见文献[11]，皆来自中国林业科学研究院林业研究所。

1.2 试验设计

试验设置培养水分含量为主处理，接种兰科菌根真菌与否为次处理。次处理为：CK，不接种兰科菌根真菌；CE，接种角担菌；TU，接种胶膜菌株；SE，接种蜡壳菌；以上处理皆基于2个水分主处理：85%正常土壤含水率(WW)、土壤50%含水率的干旱处理(DS)，共8个处理组合。各处理重复5次。

试验盆栽装置为黑色圆锥形塑料桶，上口径 18 cm、下口径15 cm、盆高22 cm。每盆装花卉培养基质2.5 kg。菌株处理采用均匀灌根方式施入，CK处理则加入无菌培养液。按照上述处理设置土壤含水量，将1年生的建兰植株转移至相应处理土壤基质中。同时采用配备园艺型ML3探头的HH-2 WET/WET-2-K1 Delta-T WET便携式土壤水分仪(上海禾工科学仪器有限公司)监测培养基质含水率，采用自动滴灌方式补充水分。

1.3 样品采集及测定分析

1.3.1 菌株重分离、抗氧化酶活性、应激产物含量及水分利用参数测定 培养结束后，取建兰接种菌株的植株和不接种处理各3株，挑选幼嫩根系采用0.1%的氯化汞(HgCl2)溶液进行表面消毒2 min，接着无菌水清洗3～5次；之后采用组织块分离法进行菌根真菌的重分离，具体操作参照陈宝玲等的方法[13]。

1.3.2 根系脂肪酸成分及含量测定 脂肪酸(FAs)的测定参考GB 5009.168—2016《食品安全国家标准 食品中脂肪酸的测定》，采用气相色谱-质谱法测定。称取-20 ℃保存的建兰根系样品50 mg、1% H2SO4和2 mL色谱级甲醇溶液加入到10 mL的PE试管中，在80 ℃下进行甲酯化反应，后续加入1.0 mL正己烷和0.5 mL乙醚，用涡旋混匀器溶解混匀进行初步萃取；再加1.0 mL甲醇、1.0 mL氢氧化钾-甲醇溶液(1 mol/L)。采用涡旋混匀器溶解混匀30 s，静置10 min；采用去离子水进行洗涤，再转移到2 mL自动进样器中。将500 μL水杨酸甲酯(50 mg/L)作为内标加入1 mL正己烷萃取液，随后通过30 m×0.25 mm的Agilent DB-WAX毛细管柱(Agilent Scientific，Santa Clara，USA) 并使用Agilent 7890A/5975C气相色谱-质谱(GC-MS)系统(Agilent Technologies，Santa Clara，USA)测定FA含量。

仪器分析条件：分流比10 ∶1，进样口温度 280 ℃，传输线温度250 ℃，进样体积为1 μL；以高纯氮气为载气，氮气流速1.0 mL/min，恒流模式，压力190 kPa。升温程序：在50 ℃下保持3 min，以 10 ℃/min 的速率升温至220 ℃，保持15 min，再以5 ℃/min的速率升温至240 ℃，保持20 min。质谱采用全扫描法测定，范围为35～780m/z。将34种脂肪酸标准品和甲酯化后的样品进行仪器分析，以脂肪酸甲酯标准溶液中各脂肪酸甲酯混合液(1 000 μg/mL)进行归一化法定量[15]。

1.3.3 脂肪酸去饱和酶相关基因表达水平测定 称取建兰根系样品50 mg采用冷冻研钵和研杵进行快速研磨，采用EASY spin Plus Plant RNA Kit试剂盒(RN38 Aidlab，北京)提取研磨样的总RNA，采用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，并采用H6132型分光光度计(H6132，Eppendorf，Hamburg，Germany)对RNA进行纯度测定。采用TRUEscript 1st Strand cDNA Synthesis Kit With gDNA Eraser (PC5402，Aidlab)将RNA逆转录为第1链cDNA。根据目前GenBank序列数据库的兰花(Cymbidium)FA基因(CyFAD2、CyFAD6、CyFAC9、CyFAZ15)，采用Primer Express 5.0软件设计扩增引物(表1)，内参基因(TUB)参考曹映辉等的研究[16]。

表1 脂肪酸去饱和酶相关基因的qRT-PCR引物序列信息

定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)包含2×10 μL AceQ qPCR SYBR Green Master Mix、0.4 μL 正反向引物、2 μL cDNA模板和7.2 μL ddH2O。使用CFX97 实时PCR检测系统(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA) 进行qRT-PCR扩增，程序如下：95 ℃预变性5 min；95 ℃熔化变性 10 s，60 ℃退火30 s，循环35次；72 ℃延伸15 s。实时定量结果采用2-ΔΔCT算法进行相对表达量分析。

1.4 数据处理与统计分析

采用Excel 2013进行数据整理，采用SPSS 23.0软件进行试验数据统计分析(α=0.05)，采用Origin 2018进行图形绘制。

2 结果与分析

2.1 干旱胁迫下菌根真菌与建兰共生体系的建立

由图1可见，未接种菌根真菌的CK处理没有观察到共生结构(图1-a)，而在接种处理中皆发现共生结构(图1-b、图1-c)。在对土壤进行的重分离中，以水分正常供应条件处理(WW)显著大于干旱条件处理(DS)，表明干旱会降低菌根真菌在土壤中存活。就试验数据来看，无论在WW还是DS条件下，各菌根真菌处理(CE、TU、SE)均以TU处理较高；其中在WW中，各处理均差异不显著，而DS条件下，两两处理间均差异显著，以TU处理分离率最高，较CE、SE分别显著提高11.33、4.66百分点。

2.2 干旱胁迫下菌根真菌对建兰氧化系统的影响

2.3 干旱胁迫下菌根真菌对建兰脂肪酸组成的影响

2.3.1 干旱胁迫下菌根真菌对建兰饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸组分的影响 基于34种脂肪酸(FAs)标准样品的GC-MS定量分析，在建兰根系中鉴定出11种饱和脂肪酸(SFA)和10种不饱和脂肪酸(UFA)(表2)。根系中的主要FAs为棕榈酸(C16：0)和硬脂酸(C18：0)，二者分别占总FAs的38.91%～47.96%和26.05%～30.15%。根系中的主要UFA为油酸(C18：1)、亚油酸(C18：2)和α-亚油酸(C18：3n3)，分别占总FAs的2.99%～5.49%、9.86%～13.84%和3.59%～5.64%。与WW条件相比，DS处理导致肉豆蔻烯酸(C14：1)、棕榈油酸(C16：1)、十七烯酸(C17：1)、油酸(C18：1)、亚油酸(C18：2)和α-亚油酸(C18：3n3)的含量整体显著降低，而接种菌根真菌与否仅影响数值大小但不能改变这种趋势。在SFA组分中，无论WW还是DS条件下，与CK处理相比， 菌根真菌接种处理均显著降低了硬脂酸(C18：0)、花生酸(C20：0)、木醋酸(C24：0)含量。在UFA组分中，无论WW还是DS条件下，与CK处理相比，菌根真菌接种处理均显著增加了肉豆蔻烯酸(C14：1)、十七烯酸(C17：1)、亚油酸(C18：2)、顺-11，14，17-二十碳三烯酸(C20：3n3)、花生四烯酸(C20：4n6)、顺-13，16-二十二碳二烯酸(C22：2)的含量。

2.3.2 干旱胁迫下菌根真菌对建兰UFA、SFA比例的影响 由图3可知，处于干旱条件(DS)下各处理根系UFA/SFA比例皆显著低于正常水分处理(WW)。就WW条件而言，各处理呈CK

2.3.3 干旱胁迫下菌根真菌对建兰脂肪酸去饱和酶相关基因表达的影响 由图4可知，处于干旱条件(DS)下各处理根系CyFAD2、CyFAD6、CyFAC9的相对表达量皆整体高于正常水分处理(WW)，而在CyFAZ15中则呈相反趋势。就CyFAD2而言，WW条件下CK显著低于接种菌根真菌处理；DS条件下亦以CK处理最低，其中与CE处理无显著差异，二者均显著小于TU、SE处理；整体来看，以DS-TU显著大于其他处理，余下处理较其显著降低29.24%～87.47%(图4-a)。在CyFAD6中，无论WW还是DS条件下，皆以CK处理显著小于菌根真菌处理，且对应处理中均以DS显著大于WW(图4-b)。在CyFAC9中，WW条件下，以菌根真菌处理小于CK处理，但两两处理间均无显著差异；在DS条件下，与CK处理相比，菌根真菌处理提高，其中TU处理显著大于CK (图4-c)。在CyFAZ15中，WW条件下较CK处理相比，菌根真菌处理显著提高476.47%～539.71%；DS条件下，菌根真菌处理亦高于CK处理，但处理间均无显著差异(图4-d)。

2.4 干旱胁迫下菌根真菌对建兰水分利用的影响

由图5可知，在水分利用效率(WUE)和相对含水量(RWC)指标中，整体以WW大于DS。无论WW还是DS条件下，与其相应水分条件的CK处理相比，胶膜菌(Tulasnellasp.)、角担菌(Ceratobasidiumsp.)和蜡壳菌(Sebacinasp.)皆整体提高了上述水分利用参数，且胶膜菌处理(TU)下各水分利用参数皆具有较优值。在WW条件下，WUE、RWC均呈CK

3 讨论

兰科菌根作为陆生植物主要的菌根类型之一，其共生关系贯穿了兰科植物从种子萌发到开花的整个生长史[11]。角担菌(Ceratobasidiumsp.)、胶膜菌(Tulasnellasp.)和蜡壳菌(Sebacinasp.)是土壤中3种重要的功能性兰科菌根真菌，三者在形态学、基因结构上较为相似[17]，然而关于三者的功能强弱知之甚少。本研究中，从建兰根系分离出的角担菌(Ceratobasidiumsp.)、胶膜菌(Tulasnellasp.)和蜡壳菌(Sebacinasp.)均可与小桃红建立共生关系，正常水分条件(WW)下，该3株真菌的土壤分离率为89.33%～91.33%；而干旱胁迫条件(DS)下分离率均显著下降，表明干旱胁迫对菌根共生存在不利影响，其中无论是否干旱胁迫下胶膜菌接种处理(TU)皆最高，其中干旱胁迫下TU处理显著高于角担菌(CE)和蜡壳菌(SE)。

脂肪酸(FAs)是细胞膜的主要组成部分，FAs分为饱和脂肪酸(SFA)和不饱和脂肪酸(UFA)，SFA与UFA间的转化对细胞的生理功能起着重要作用[18]，较高的UFA含量被视为植物耐旱性的重要体现。本研究发现棕榈酸(C16：0)、硬脂酸(C18：0)、油酸(C18：1)、亚油酸(C18：2)和α-亚油酸(C18：3n3)是建兰根系FAs的主要成分；与CK处理相比，接种菌根真菌处理在WW和DS条件下均表现出更高的UFA/SFA值，接种菌根真菌处理提高植株脂肪酸不饱和度归因于SFA减少(主要为C18：0、C20：0、C24：0)和UFA增加(主要为C14：1、C17：1、C18：2和C20：3n3、C20：4n6、C22：2)，这意味着接种菌根真菌可保持细胞膜的流动性，从而提高植株水分利用效率[19]。

组织中FAs的组成和不饱和度显著影响细胞膜脂质流动性，其饱和度主要由FAs去饱和酶基因表达调控[20]。本研究中，与CK处理相比，DS条件下菌根真菌处理的CyFAC9表达量发生显著上调，而在WW下没有明显差异。在高等植物中FAC9可调控棕榈酸、硬脂酸双键的合成，从而转化为棕榈油酸(C16：1)、油酸(C18：1)[18]。因此DS条件下CyFAC9表达上调导致菌根真菌接种处理中C18：1含量增加。前人研究表明，FAZ15的表达可使C18：2去饱和转化为α-亚油酸(C18：3n3)[21]。WW条件下，与CK处理相比，接种菌根真菌处理根系中C18：3n3含量的显著升高归因于CyFAZ15的超高表达。此外，本研究表明建兰根系中CyFAD2、CyFAD6的表达模式与亚油酸(C18：2)含量的变化趋势基本一致；然而，本研究中，并非所有基因都与其相应FAs含量呈完全一致的趋势，例如CyFAC9的表达模式与C16：1(在WW和DS下)和C18：1含量变化之间存在差异性。这可能是由于：(1)单个脂肪酸的去饱和酶由多个基因控制，而不是由单个基因控制[18，22]；(2)植物根部的FAs含量存在动态变化，FAs去饱和酶基因的上调表达并不一定意味着其相应的FAs积累更多[8，20]。

水分利用参数可反映环境水分不足时植物组织在蒸腾作用过程中的耗水程度和恢复能力的差异[26]。本研究表明，与WW相比，DS环境下的水分利用效率(WUE)及相对含水量(RWC)均较低，且无论WW还是DS条件下，CE、SE处理皆提高了WUE和RWC，但整体以SE处理优于CE处理。前人研究表明兰科菌根真菌自由基菌丝是亲水性蛋白菌丝，可有效吸附水分，或通过保护自由基菌丝免受外部环境干燥的影响[27]，这可能是兰科菌根真菌处理提高水分利用的原因。此外，本研究表明无论WW还是DS条件下，TU处理均具有较大值，且较WW-CK处理相比，WUE、RWC指标中DS-TU处理分别显著提高26.92%、4.41%。

4 结论

本研究表明，接种角担菌(Ceratobasidiumsp.)、胶膜菌(Tulasnellasp.)和蜡壳菌(Sebacinasp.)提高了建兰通过调控脂肪酸去饱和酶基因(CyFAD2、CyFAD6、CyFAC9、CyFAZ15)的表达，显著增加了正常水分(WW)和干旱条件(DS)条件下建兰根系肉豆蔻烯酸(C14：1)、十七烯酸(C17：1)、亚油酸(C18：2)、顺-11，14，17-二十碳三烯酸(C20：3n3)、花生四烯酸(C20：4n6)、顺-13，16-二十二碳二烯酸(C22：2)含量以及降低了硬脂酸(C18：0)、花生酸(C20：0)、木醋酸(C24：0)的合成；菌根化建兰根系脂肪酸的组成变化导致根系脂肪酸的不饱和指数更高，此外，菌根真菌显著降低了丙二醛和超氧阴离子自由基含量，这有助于降低氧化损伤。从水分利用试验数据结果来看，干旱胁迫下以接种胶膜菌(Tulasnellasp.)效果较佳。