丹酚酸B通过Ctsk/STAT3轴对小鼠口腔癌的抑制作用*

杜雯雯 廖镇 王娟 王茜

(1.重庆市第九人民医院口腔科，重庆， 400700；2.郑州大学第一附属医院口腔正畸科，河南 郑州 450000)

口腔癌是头颈部最典型的恶性肿瘤之一，包括舌癌、牙龈癌、颊黏膜癌、唇癌及颌骨癌等，因其易转移、预后差，采取有效手段预防口腔癌症显得尤为重要[1-2]。目前对于口腔癌的主要治疗手段为癌症化学预防，但化学预防药物的长期耐药性及不良反应导致治疗效果不佳，开发新的以天然植物为基础的抗肿瘤药物，是目前抑制肿瘤药物研发热点。活血化瘀是中医治疗常用手段，临床研究显示，活血化瘀药物具有抗凝血，抑制癌细胞增生、转移，调节机体自身免疫等作用[3-4]。丹参作为临床治疗常用中药，可通过调节机体免疫功能、抑制肿瘤细胞增殖、分化和凋亡等发挥抗炎、抗肿瘤作用[5-6]。丹酚酸B是一种从丹参中提取的水溶性酚酸类化合物，作为丹参最具代表的单体成分，含量高、且作用效果强[7-8]。有研究表明，丹酚酸B可减轻大鼠结肠癌炎性反应及病理损伤，抑制细胞增殖，从而发挥抗肿瘤作用[9]。本研究通过建立口腔癌模型，初步探讨丹酚酸B对小鼠口腔癌的抑制作用，为丹酚酸B相关药物研发及肿瘤临床治疗口腔癌提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 选取SPF级C57BL/6雄性小鼠100只，体重(20±3)g，6周龄，购自上海菲诺克生物科技有限公司，许可证号：SCXK(沪)2018-0005，光照昼夜交替12 h，室温饲养1周。本研究通过医院动物伦理委员会审核通过。

1.1.2 药物、主要试剂和仪器 丹酚酸B，纯度98%，成都植标化纯生物技术有限公司；顺铂注射液，国药准字：H20043889，云南植物药业有限公司；白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)ELISA试剂盒，美国R&D公司；DAB显色试剂盒，美国Sigma公司；兔抗5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-deoxyUridine，BrdU)单抗、组织蛋白酶K(cathepsin K，Ctsk)单抗、信号转导子和转录激活子3(hosphorylated signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)单抗、磷酸化信号转导子和转录激活子3(p-hosphorylated signal transducer and activator of transcription 3，p-STAT3)单抗、信号传导抑制因子3(recombinant suppressors of cytokine Signaling 3，SOCS3)多抗、羊抗兔二抗-HRP，英国Abcam公司；电泳仪、垂直电泳槽，美国Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 建模、分组 随机选取80只小鼠，建立口腔癌模型[10]：采用致癌剂4-硝基喹啉-1-氧化物(4-nitroquino-line-1-oxide，4NQO)诱导法，将含有0.5%的4NQO丙二醇溶液涂于小鼠口腔颊囊两侧，3次/周，共4周。当小鼠口腔颊囊黏膜组织相继出现白色斑块、溃疡、糜烂、颗粒状增生等现象，即为造模成功。建模成功后随机分为模型组、丹酚酸B低剂量组、丹酚酸B高剂量组、阳性药物组，每组20只，余下20只为对照组，对照组小鼠口腔涂抹丙二醇溶液。

1.2.2 干预方法 建模成功后24 h，对照组每日灌服等量蒸馏水；丹酚酸B低、高剂量组、阳性药物组分别灌服10 mg·kg-1、40 mg·kg-1丹酚酸B溶液及4 mg·kg-1顺铂溶液，各100 μL，1次/日，共计4周。

1.2.3 样品采集 末次给药干预后24 h，小鼠腹腔注射20 μL BrdU，2 h后脱颈处死，剥离口腔颊囊黏膜组织，一部分置于4%多聚甲醛固定备用，另一部分则于-80℃存储备用。

1.2.4 病理组织学观察 取4%多聚甲醛固定备用1/2口腔颊囊黏膜组织，石蜡包埋，切片(5 μm)，加热脱蜡，苏木精染色(3～5 min)、清洗、置于1%(v/v)H2O2浸泡(10～30 s)，水洗、伊红染色(20 min)，水洗，脱水(10 min)，透化(二甲苯，10 min)，中性树脂封固，光学显微镜观察，依据WHO癌症诊断标准[11]，将小鼠口腔颊囊黏膜组织病变分为单纯增生、异常增生(轻度异常增生、重度异常增生)、鳞癌等不同病理现象，并记录四种病理现象的数目，取平均值。

1.2.5 细胞增殖 取4%多聚甲醛固定备用1/2口腔颊囊黏膜组织，切片，Brdu免疫组化ABC染色，测定细胞增殖活性，选取5个视野，光学显微镜下(200×)记录被Brdu标记的阳性细胞数及总细胞数。增殖指数以每100个细胞中被Brdu标记的阳性细胞数表示。

1.2.6 促炎因子检测 取-80℃存储备用1/3口腔颊囊黏膜组织，加入组织裂解液匀浆，离心(12000 r/min，5 min，离心半径20 cm)取上清液。酶联免疫吸附法(ELISA)测定IL-6、IL-1β、VEGF、HIF-1α含量，酶标仪检测在450 nm处吸光度值，根据标准曲线计算口腔颊囊黏膜组织IL-6、IL-1β、VEGF、HIF-1α含量。

1.2.7 Ctsk、STAT3、SOCS3 mRNA水平检测 取-80℃存储备用1/3口腔颊囊黏膜组织，匀浆，Trizol法提取RNA，测其纯度与浓度，并逆转录得cDNA，进行实时荧光定量PCR反应。反应体系：1.2 μL Taq聚合酶、1 μL上下游引物、4 μL模板cDNA、18.8 μL ddH2O。扩增条件：预变性(94℃，30 s)、变性(94℃，5 s)、退火(59℃，30 s)，共40个循环，加熔解曲线，降温(50℃，30 s)。以β-actin为内参基因，数据分析采用2-△△Ct法，重复多次，取Ct均值。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.2.8 Ctsk、STAT3、p-STAT3、SOCS3蛋白表达水平检测 取-80℃存储备用1/3口腔颊囊黏膜组织，添加RIPA裂解缓冲液离心取上清，蛋白BCA试剂盒确定总蛋白浓度，待测蛋白样品进行电泳分离(100V，80 min)，转至聚偏二氟乙烯膜(250 mA恒流)，5%脱脂牛奶的磷酸盐缓冲液封闭(2 h)，将样品与Ctsk(1∶1000)、STAT3(1∶1000)、p-STAT3(1∶1000)、SOCS3(1∶1000)一抗进行孵育(4℃，24 h)，TBST缓冲液洗膜，加二抗(HRP标记的IgG，1∶5000)室温孵育2 h，洗膜，曝光，显影。Image J软件测样品条带与β-actin条带灰度值。其中目标蛋白相对表达水平计算为目标条带与β-条带灰度比值。

2 结果

2.1 建模结果 未建模小鼠口腔黏膜结构正常，未发生病变，黏膜层次清晰，基底平滑，无明显凸起；参与建模小鼠口腔黏膜上皮细胞极性消失，出现异常增生、异型性细胞，严重者发展为原位癌。见图1。

图1 建模与未建模小鼠口腔黏膜病理学变化(HE×200)

2.2 组口腔颊囊黏膜组织病理学观察 HE结果显示，对照组小鼠口腔颊囊黏膜细胞结构完整，层次清晰，排列整齐，未出现血管扩张现象；模型组黏膜细胞结构、层次紊乱，且出现大量脱落，大量炎症性细胞浸润，出现异型增生现象；丹酚酸B低、高剂量组以及阳性药物组黏膜细胞结构相对完整，出现部分炎性细胞浸润、轻度毛细血管扩张现象，且丹酚酸B高剂量组与阳性药物组改善明显。见图2。单纯增生、轻度异常增生、重度异常增生、鳞癌病理程度组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，丹酚酸B低、高剂量组与阳性药物组单纯增生、轻度异常增生、重度异常增生、鳞癌病理程度降低(P<0.05)；与丹酚酸B低剂量组比较，丹酚酸B高剂量组与阳性药物组单纯增生、轻度异常增生、重度异常增生、鳞癌病理程度降低，且阳性药物组显著低于丹酚酸B高剂量组(P<0.05)。见表2。

表2 口腔癌病变结果分析比较

图2 口腔颊囊黏膜组织病理学变化(HE×200)

2.3 细胞增殖指数比较 Brd U免疫组化结果显示，单纯增生、轻度异常增生、重度异常增生、鳞癌细胞增殖指数组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，丹酚酸B低、高剂量组与阳性药物组单纯增生、轻度异常增生、重度异常增生、鳞癌细胞增殖指数降低(P<0.05)；与丹酚酸B低剂量组比较，丹酚酸B高剂量组与阳性药物组单纯增生、轻度异常增生、重度异常增生、鳞癌细胞增殖指数降低，且阳性药物组低于丹酚酸B高剂量组(P<0.05)。见表3、图3。

图3 Brd U免疫组化染色(200×)

表3 口腔黏膜上皮细胞增殖指数比较

2.4 促炎因子水平比较 口腔颊囊黏膜组织IL-6、IL-1β、VEGF、HIF-1α水平组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较，模型组IL-6、IL-1β、VEGF、HIF-1α水平升高(P<0.05)；与模型组比较，丹酚酸B低、高剂量组与阳性药物组IL-6、IL-1β、VEGF、HIF-1α水平降低(P<0.05)；与丹酚酸B低剂量组比较，丹酚酸B高剂量组与阳性药物组IL-6、IL-1β、VEGF、HIF-1α水平降低，且阳性药物组低于丹酚酸B高剂量组(P<0.05)。见表4。

表4 口腔颊囊黏膜组织IL-6、IL-1β、VEGF、HIF-1α水平比较

2.5 Ctsk、STAT3、SOCS3 mRNA水平比较 口腔颊囊黏膜组织Ctsk、SOCS3 mRNA水平组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较，模型组Ctsk mRNA水平升高，SOCS3 mRNA水平降低(P<0.05)；与模型组比较，丹酚酸B低、高剂量组与阳性药物组SOCS3 mRNA水平升高，Ctsk mRNA水平降低(P<0.05)；与丹酚酸B低剂量组比较，丹酚酸B高剂量组与阳性药物组SOCS3 mRNA水平升高，Ctsk mRNA水平降低(P<0.05)；与丹酚酸B高剂量组比较，阳性药物组SOCS3 mRNA水平升高，Ctsk mRNA水平降低(P<0.05)。见图4。

图4 口腔颊囊黏膜组织Ctsk、STAT3、SOCS3 mRNA水平比较(n=5)

2.6 Ctsk、STAT3、p-STAT3、SOCS3蛋白水平比较 口腔颊囊黏膜组织Ctsk、p-STAT3、SOCS3蛋白水平组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较，模型组Ctsk、p-STAT3蛋白水平升高，SOCS3蛋白水平降低(P<0.05)；与模型组比较，丹酚酸B低、高剂量组与阳性药物组SOCS3蛋白水平升高，Ctsk、p-STAT3蛋白水平降低(P<0.05)；与丹酚酸B低剂量组比较，丹酚酸B高剂量组与阳性药物组SOCS3蛋白水平升高，Ctsk、p-STAT3蛋白水平降低(P<0.05)；与丹酚酸B高剂量组比较，阳性药物组SOCS3蛋白水平升高，Ctsk、p-STAT3蛋白水平降低(P<0.05)。见图5。

图5 口腔颊囊黏膜组织Ctsk、STAT3、p-STAT3、SOCS3蛋白表达(n=5)

3 讨论

口腔黏膜癌一种发病率高、易转移、浸润较快的黏膜上皮恶性肿瘤，其中以口腔鳞状细胞癌为主，即典型表现为口腔黏膜上鳞状细胞发生癌变[12-13]。由于口腔癌发展进程极其复杂，且伴随着庞杂生物学行为，使得临床研究出现各种局限性、不确定性，致使其发病机制研究更加困难，这也一直是众多学者面临的科研难题。

癌症发生的关键因素为细胞过度增殖、凋亡，作为胸腺嘧啶类似物代表之一，Brd U可替代胸腺嘧啶参加S期细胞DNA复制，细胞增殖指数代表其活跃程度[14]。慢性炎症和各类肿瘤病发相关，其中口腔癌的发生与口腔长期慢性炎症密不可分[15]。马滢等[16]研究显示，丹酚酸B可通过抑制相关信号通路，明显减轻小鼠肝纤维化-肝细胞癌进程，发挥抑癌作用。张琳等[17]研究认为，丹酚酸B对结肠癌细胞的增殖具有显著抑制作用。另外也有报道显示，丹酚酸B可诱导胶质瘤细胞自噬性死亡[18]。以上研究均提示丹酚酸B可通过不同途径发挥抗癌作用，此外，丹酚酸B的抗炎作用也已得到证实[19]。本研究使用丹酚酸B干预口腔癌小鼠，结果发现，经丹酚酸B干预后，单纯增生、轻度异常增生、重度异常增生、鳞癌等病理程度及Brd U细胞增殖指数，IL-6、IL-1β、VEGF、HIF-1α水平降低，提示丹酚酸B可通过降低口腔黏膜组织上皮细胞过度增殖，改善炎性反应，减轻病理损伤，抑制小鼠口腔癌发生。HE结果显示，丹酚酸B低、高剂量组与阳性药物组口腔黏膜组织不同病理现象均较模型组出现改善，其中丹酚酸B高剂量组与阳性药物组改善明显，说明口腔癌的发生与细胞过度增殖息息相关，提示丹酚酸B作为口腔癌药物治疗手段，应用前景广阔。

致癌信号通路失调是癌症的标志，其中STAT信号通路在肿瘤发生发展过程中发挥重要作用[20]。STAT家族将信号从细胞膜传至细胞核，在细胞存活与功能活动中起核心作用[21]。STAT可调节细胞免疫和癌症进展，作为最重要的转录因子之一，STAT3可被细胞因子或生长因子激活，而STAT3异常激活可引起细胞不受限制增殖和恶性转化[22-23]。研究表明，STAT3信号因子与多种肿瘤进展直接相关，例如参与胰腺癌、乳腺癌和肺癌等肿瘤发展进程[24-26]。STAT3作为细胞因子和生长因子信号，可调控下游SOCS3表达，从而调节多种致癌基因的转录，且STAT3上调也与自身不良预后有关[27]。Jiang等[28]研究显示，激活STAT3通路，可促进口腔癌细胞增殖。Ctsk与多种疾病的发生发展关系密切，在牙周炎、口腔癌等口腔颌面部疾病中发挥重要作用[29-30]。调控Ctsk/STAT3轴关键分子表达，可影响细胞增殖、分化和成熟过程[31]。本研究结果显示，丹酚酸B能降低Ctsk mRNA和蛋白以及p-STAT3和SOCS3蛋白表达，说明丹酚酸B可介导Ctsk因子表达，并激活STAT3通路，抑制肿瘤细胞增殖与分化，提示丹酚酸B可抑制Ctsk/STAT3轴关键分子表达调控肿瘤细胞的生物学活性，从而发挥对小鼠口腔癌的抑制作用。

4 结论

本研究结果显示，丹酚酸B对小鼠口腔癌具有明显抑制作用，可能通过调控Ctsk/STAT3轴相关mRNA和蛋白表达，减轻炎症反应，抑制口腔黏膜异常增生，改善病理损伤，为丹酚酸B相关药物研发及临床口腔癌治疗提供了新思路。但丹酚酸B是否可通过其他机制发挥抗癌作用，尚需进一步研究。