果王素通过下调NPM表达对小鼠移植肺腺癌生长和转移的抑制作用*

钟柏英 贺立洋 周美玲 贺兼斌

(1.南华大学附属怀化医院肿瘤中心，湖南 怀化 418000；2.怀化市第一人民医院呼吸与危重症医学科，湖南 怀化 418000)

世界卫生组织国际癌症研究署2018年的统计数据显示，全球每年新发病肺癌患者超过200万，死亡病例数高达180万[1-2]，肺癌在恶性肿瘤中发病率和死亡率高居榜首，其发病率和死亡率一直居高不下，给家庭和社会带来了沉重负担。肺癌按组织病理学分为非小细胞肺癌和小细胞肺癌，非小细胞肺癌包括腺癌、鳞癌和大细胞癌，近年来肺腺癌在非小细胞肺癌中比例逐渐升高。由于肺癌无特征性症状，早期诊断困难，约75%的患者诊断时已处于中晚期[3],大部分中晚期患者无手术治疗机会，放化疗为该类患者的标准治疗方案,但近年来其疗效已达到瓶颈，且副作用严重，部分患者因不能耐受放化疗的毒副作用而中断治疗[4]。因此寻找高效、低毒的抗癌药物，是人类将来抗肿瘤治疗的新策略之一。果王素(猕猴桃果仁油脂肪酸)(Kiwi fruit essence，unsaturated fatty acid of Actinidia chinesis planch seed oil)具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎等作用。课题组前期研究表明[5-6]，果王素能有效抑制小鼠肺腺癌的生长和转移，但其具体的抗肿瘤机制尚不太明确。核仁磷酸蛋白(Nucleophosmin，NPM)是一类能穿梭于核仁、核质与胞质之间在细胞增殖和生长中发挥重要调控作用的多功能核仁蛋白[7-8]。有研究显示[9-12]，在多种肿瘤组织中NPM呈过表达，而且肿瘤的分期越晚、组织分化越差，NPM的表达水平越高。目前对于果王素是否通过调控NPM的表达抑制肺腺癌的生长与转移，报道鲜少。本研究通过构建小鼠肺腺癌移植瘤模型，予以每组小鼠不同剂量的果王素进行干预，观察各组小鼠移植瘤生长和转移情况，检测移植瘤组织中NPM蛋白及mRNA的表达水平，探索果王素抗肿瘤的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 Lewis肺腺癌荷瘤种鼠(鼠源)2只，购于中国医学科学院基础医学研究所细胞中心，C57BL/6J 雄性小鼠32只，体重(20±2)g，购于中国医学科学院肿瘤医院实验动物中心(许可证号：SYXK[京]2019-0019)，本研究通过本院动物伦理审查(快KY-2019082205)。

1.1.2 实验试剂 果王素(中华猕猴桃果仁非饱和脂肪酸含量为600 g/L)购买于湘西老爹生物有限公司，兔抗鼠NPM多克隆抗体、β-actin、HRP标记山羊抗兔IgG购于北京博奥森生物技术有限公司，BCA法蛋白定量检测试剂盒由上海碧云天生物技术有限公司提供，SP试剂盒、DAB显色剂购自北京索莱宝科技有限公司，TRIzol试剂与PVDF膜购于美国Invitrogen公司，逆转录试剂盒和PCR扩增试剂盒购于美国Promega公司，武汉博尔夫生物科技有限公司合成NPM、β-actin引物。

1.2 方法

1.2.1 构建实验动物模型 断颈处死Lewis肺腺癌荷瘤种鼠，无菌条件下剥离肿瘤，取无坏死的实性肿瘤组织，剪碎，加入生理盐水(1g肿瘤：4 mL生理盐水)匀浆，325目钢网滤过为肿瘤细胞悬液。C57BL/6J 小鼠右后腿根部外侧皮下注射 0.2 mL肿瘤细胞悬液，构建肺腺癌小鼠皮下移植瘤模型。

1.2.2 实验分组及药物干预 32只小鼠接种后第4天随机分为4组：对照组、低剂量果王素组、中剂量果王素组和高剂量果王素组，每组8只，予以药物干预。对照组小鼠予以0.3 mL生理盐水每天灌胃一次，低剂量果王素组小鼠予以60 mg/kg果王素稀释于0.3 mL生理盐水每天灌胃一次，中剂量果王素组小鼠予以120 mg/kg果王素稀释于0.3 mL生理盐水每天灌胃一次，高剂量果王素组小鼠予以240 mg/kg果王素稀释于0.3 mL生理盐水每天灌胃一次。果王素组的干预药物剂量按照相关文献及课题组前期研究确定[5-6]。

1.2.3 观察移植瘤生长和转移 肿瘤细胞接种后第24天处死全部小鼠，分离皮下移植瘤，测量最长径a和短径b，按公式V=0.52a×b2计算肿瘤体积，称肿瘤重量，按公式V=(1-ET/EC)×100%计算抑瘤率(ET为果王素组平均瘤重，EC为对照组平均瘤重)，一部分肿瘤组织经液氮速冻后，保存于-70℃冰箱待用，剩余肿瘤组织用4%中性甲醛溶液固定后包埋于石蜡。剖胸取双肺，置入Boins液处理后，计数小鼠双肺表面转移结节，按公式计算肺转移抑制率=(1-QT/QC)×100%(QT为果王素组平均转移结节数，QC为对照组平均转移结节数)。

1.2.4 免疫组化法检测移植瘤组织NPM蛋白表达 把移植瘤组织包埋于石蜡后切片，行二甲苯脱辣、梯度酒精脱水、抗原修复、阻断灭活内源性过氧化物酶，然后用正常山羊血清37℃封闭10 min，滴加一抗(兔抗鼠Nucleophosmin多克隆抗体)，用PBS缓冲液替代一抗为阴性对照，4℃冰箱孵育过夜，第二天滴加HRP标记的二抗，37℃孵育30 min，滴加SP，37℃孵育30 min，然后行DAB染色、苏木素复染，常规脱水、透明、封片。采用显微镜阅片，NPM染色结果判定标准：细胞核中出现清晰棕黄色或棕褐色颗粒为阳性，选择阳性细胞密集区域，排除坏死区，每张切片计数10个高倍视野100个细胞并采用全自动图像分析系统测定平均灰度值(灰度值越高,其蛋白质表达越高)。

1.2.5 免疫印迹法检测移植瘤组织NPM蛋白表达 取适量各组冻存的移植瘤肿瘤组织，用RIPA蛋白裂解液从组织样本中提取细胞蛋白，用BCA法测定各组移植瘤组织的蛋白质浓度，予以相同的上样量，行SDS- PAGE凝胶电泳后湿转蛋白于PVDF膜上，转膜后室温下用5%脱脂牛奶封闭过夜，在PVDF膜上加入按1∶1000稀释的一抗(兔抗鼠NPM)，4℃摇床孵育过夜，第二天用TBST冲洗3次，加入HRP标记的二抗(山羊抗兔IgG)，室温摇床孵育1 h，再次用TBST冲洗3次，在避光容器中把现配的ECL发光液滴在PVDF膜上均匀覆盖，暗室显影曝光，扫描胶片，用Labwork凝胶图像分析系统分析各组条带的光密度值，计算出NPM的蛋白相对表达量。

1.2.6 实时荧光定量PCR检测移植瘤组织NPM mRNA 表达 取适量各组冻存的移植瘤肿瘤组织，用TRIzol试剂提取组织样本中的RNA，将RNA通过逆转录试剂盒反转录为cDNA，然后进行PCR扩增，由上海生工公司参照NPM、β-actin基因序列合成所用引物(表1)，取10 μL cDNA稀释液，在荧光定量PCR仪上行PCR反应，以β-actin为内参照，计算2-ΔΔCt值，分析NPM mRNA表达水平。

表1 引物序列

2 结果

2.1 果王素抑制小鼠移植瘤的生长和转移 实验过程中小鼠皆存活，无死亡，接种瘤细胞后，所有小鼠皮下移植处均成瘤，药物干预前各组小鼠皮下移植瘤大小无明显差异，呈局部小结节，接种第18～24天，果王素处理组皮下移植瘤体积较对照组明显小，且高剂量果王素组肿瘤最小。处死小鼠，解剖观察各组小鼠移植瘤大小和双肺转移结节数量，见各剂量果王素处理组皮下移植瘤体积、质量和双肺表面转移结节数均较对照组明显降低(P<0.05)，肿瘤抑制率和肺表面结节转移抑制率随果王素剂量升高而升高，组间比较有显著性差异(P<0.05)，移植瘤生长和转移情况，见表2。

2.2 果王素下调小鼠皮下移植瘤中NPM蛋白的表达 NPM蛋白表达于肿瘤细胞胞核中，免疫组织化学染色后细胞核中出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性。对照组出现较多NPM阳性细胞，低、中、高剂量果王素处理组阳性细胞明显减少，而且随着果王素剂量升高，NPM阳性表达依次减少，各组之间相比差异均有统计学意义(P<0.01)，见图1。Western blot 法检测皮下移植瘤NPM蛋白表达与免疫组织化学法检测结果相一致，见图2。

图1 各组小鼠皮下移植瘤中NPM蛋白表达

图2 各组小鼠皮下移植瘤中NPM蛋白表达水平(Western blot)

2.3 果王素下调小鼠皮下移植瘤中NPM mRNA水平 实时荧光定量PCR显示，各剂量果王素处理组NPM mRNA的表达水平均较对照组明显下降(P<0.01)，果王素剂量升高，NPM mRNA的表达水平下降更明显，各组间比较差异有统计学意义(P<0.01)，见图3。

图3 各组小鼠皮下移植瘤中NPM mRNA表达水平(qRT-PCR)

3 讨论

肺癌的发病率和恶性程度皆高，易出现远处转移，大部分患者在确诊后由于进入中晚期而失去了手术根除机会，预后较差。在肺癌的病理类型中，肺腺癌由于血管丰富，更易快速生长和转移，给治疗带来很大困难，而对于中晚期肺癌，本世纪以前，放化疗是主要的治疗手段，但其毒副作用大而治疗效果不理想，因而寻找有效而毒副作用小的治疗药物成为重要课题。果王素为中华猕猴桃果仁提取物，主要成分为a-亚麻酸，含有一定量维生索E及微量元素硒等物质，具有抗癌、抗氧化、保护正常组织细胞活性的作用。课题组早期研究[5-6,13-14]发现，在肺腺癌小鼠移植瘤模型中，我们使用果王素与GP化疗方案治疗对照，即肿瘤接种4 d后果王素180 mg/kg每日灌胃1次，共14 d及肿瘤接种后第 5、12、19 d腹腔注射顺铂、吉西他滨各1次,顺铂剂量3 mg/kg,吉西他滨剂量50 mg/kg，在肿瘤接种20 d后处死全部小鼠，结果显示果王素对肺腺癌小鼠移植瘤的生长有明显抑制作用，虽然其抑制作用仍劣于GP方案化疗组(抑瘤率为14.95%及41.77%)，但转移抑制率却优于GP方案化疗组(转移抑制率为74.0%及36.3%)，说明果王素可明显抑制肺腺癌小鼠移植瘤的生长和转移，特别是在抑制转移方面的作用更明显。在本研究中果王素呈剂量依赖性抑制小鼠肺腺癌移植瘤的生长和转移，与既往的研究结果一致。

恶性肿瘤是细胞生长与增殖调控发生严重紊乱的结果，其发生具有复杂的分子基础，包括抑癌基因失活、原癌基因激活、凋亡调节基因和DNA修复基因功能紊乱等多种内因外因复杂的交互作用。肺癌和其他恶性肿瘤一样，其发生发展受多种因素的影响，但目前对其具体的分子机制尚不完全清楚。探寻肺癌发生发展过程所涉及基因及基因产物，有利于揭示肺癌的发病机制，并为肺癌的早期诊断、预后评估提供依据，同时这些基因及基因产物亦可能成为肺癌靶向治疗潜在的靶标，为肺癌的治疗开辟新的治疗途径。我们前期研究表明果王素抑制肺腺癌生长和转移可能与其抗氧化和上调含EH结构域蛋白2有关[5-6]，但由于肺癌发生发展过程中，有复杂的分子信息网络交互作用，果王素抗肺癌生长和转移的具体作用机制远未清楚。NPM是银染核仁组织区域蛋白之一，是主要的核仁磷酸化蛋白，能在核仁、核质和细胞胞质之间穿梭，具有多种功能，如与核糖体生物合成、RNA的装配与合成、染色体复制、调节抑癌基因p14和p53活性、作为分子伴侣阻止蛋白集聚等分子生物过程密切相关，而且还参与细胞增殖和监控核仁活性[15-16]。有研究[17]表明，NPM突变与急性髓细胞白血病的发生、发展密切相关，NPM水平增高往往提示急性髓细胞白血病患者复发难治。NPM在肿瘤和增殖期细胞中的含量明显高于静止期细胞，在凋亡细胞中NPM表达水平下降，NPM过表达可促进细胞生长和增殖并抑制细胞凋亡，有研究证实NPM具有原癌基因的特征，直接参与了肿瘤细胞的形成，NPM在多种实体肿瘤组织中过表达促进肿瘤的进展及转移，例如肾癌[9]、胃癌[11]、子宫内膜癌[18]、前列腺癌[19]、结直肠癌[20]等，可能为上述肿瘤的肿瘤标志物之一。但目前NPM与肺癌的关系报道较少，课题组的前期研究[21-22]表明，NPM的高表达可能促进肺腺癌生长与转移，同时与减低肺腺癌对化疗的敏感性或促进化疗耐药有关。为探索果王素是否通过调控NPM的表达，抑制肺腺癌的生长与转移，本研究通过免疫组织化学法和蛋白免疫印迹法检测小鼠肺腺癌移植瘤内NPM蛋白的表达量，用qRT-PCR法检测小鼠肺腺癌移植瘤中的NPM mRNA的表达水平，实验结果显示，对照组肿瘤组织中NPM蛋白和mRNA呈高表达，而果王素处理组NPM蛋白和mRNA的表达水平均较对照组降低，且随果王素剂量越高，NPM蛋白和mRNA的表达水平越低，高剂量果王素处理组最低，各组间的比较均有显著性差异。实验结果表明，果王素可抑制小鼠肺腺癌移植肿瘤组织中NPM的过表达，且抑制作用与果王素浓度呈正相关，说明果王素可能通过下调NPM的表达抑制小鼠肺腺癌移植瘤的生长和转移。NPM在多种人类癌症中均有表达，可能同时具有致癌和抑癌两种活性，其具体机制可能与调控癌基因及抑癌基因表达，介导多种信号通路诱发肿瘤耐药的发生有关[9,23-24]，本课题未进行果王素调节NPM的具体直接机制的研究，有待于在以后的研究中进一步完善。

综上所述，果王素可呈剂量依赖性抑制小鼠肺腺癌移植瘤的生长和转移并下调移植瘤组织中NPM基因及蛋白表达，果王素的抑瘤作用机制可能与下调NPM的表达有关，同时本研究提示NPM可能成为肺腺癌治疗的潜在靶点。

4 结论

果王素可能通过下调NPM蛋白及基因表达，抑制小鼠肺腺癌移植瘤生长和转移。