翠云草细胞壁组成特性

李 林

（广西艺术学院 建筑艺术学院，广西南宁 530007）

翠云草（Selaginella uncinata）是卷柏科（Selaginellaceae）卷柏属多年生观赏蕨类；在荫蔽的栽培环境下，其叶片呈蓝色。翠云草的蓝色叶与其叶片细胞壁有关，是由于其叶片上层表皮外侧细胞壁内的两层薄膜干涉滤器，引发光的薄膜干涉[1]。细胞壁主要组分为纤维素、半纤维素、果胶质、木质素、少量蛋白质及矿物质等，其分布和排列方式共同决定细胞壁特性[2-3]。在不同细胞类型甚至是同一细胞壁上不同部位，均存在细胞壁胞壁组成及尺寸厚度的差异[4]。近年来，为推动生物质能源转化，植物细胞壁作为可再生能源物质，其基础和应用研究进展很快。李丰成[5]利用收集到的大群体芒草（Miscanthus）材料，从生物质降解转化、能源植物选育及生物质合成机理3个层面进行植物细胞壁结构特征与生物质高效利用分子机理的研究；韦鹏练[6]以毛竹（Phyllostachys edulis）为研究对象，利用现代光谱技术，从多细胞、双细胞和单细胞3个层次，对毛竹细胞壁主要化学组分的分布展开研究。细胞壁作为植物细胞抵抗外界环境胁迫的第一道屏障，在细胞响应外界逆境胁迫时具有重要作用[7]。细胞壁对逆境的响应表现在很多方面，如细胞壁结构变化、细胞壁多糖组分变化、结构多糖的修饰变化、细胞壁蛋白和酶的变化及质外体小分子物质的动态变化等[8]。Houston等[9]研究发现，单子叶植物和双子叶植物细胞壁相关基因对不同病原菌和非生物胁迫的应答相似，细胞壁在胁迫中具有共同的重塑机制，即利用细胞壁相关基因对细胞壁结构进行多样化修饰，并有一整套精确的胁迫应答转录因子对其进行调控。

翠云草属荫生植物，本课题组在项目前期研究中设计不同光强处理，利用全光照对翠云草形成胁迫，得到2种颜色差异较大的叶片（翠云草蓝色叶和红色叶），用于后续研究[10]。为得到更全面的细胞壁组成信息，选择与翠云草同属的小翠云（S.kraussiana）（叶片为绿色）进行对比研究。前期研究通过离子色谱鉴定出翠云草细胞壁中的10种单糖成分，分别为甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖酸、半乳糖酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和岩藻糖，发现各单糖组分含量在3种叶片中均差异显著[11]。造成因素（细胞壁结构多糖中的纤维素、半纤维素或果胶质）尚不了解。本研究分别提取和测定3种材料细胞壁中的纤维素、半纤维素、果胶质和木质素含量，采用高效液相色谱法（HPLC）测定3种材料中的木质素单体，通过比较它们的含量差异，了解翠云草细胞壁组成特性，为进一步挖掘翠云草蓝色叶的关键基因奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为栽培于广西大学林学院苗圃（108°22'E，22°48'N）3层遮荫棚下（光强为65～105 μmol·m-2·s-1）的蓝色叶翠云草和绿色叶小翠云、全光照下（光强为500～520 μmol·m-2·s-1）的红色叶翠云草新鲜叶片。随机采集各个方向正常生长的成熟叶片100 g，粉碎机粉碎后过40目筛。55℃烘干至恒重，50℃烘箱保存，备用。

1.2 研究方法

试验中用到的主要仪器为WATERS515泵液相色谱仪（515泵、2690分离单元、2470紫外检测器）、多管架自动平衡离心机（湖南湘仪TDZ5-WS）、旋转蒸发器（上海亚荣RE-52AA）、循环水真空泵（上海东玺SHZ-D型）、SYP智能玻璃恒温水浴锅、分光光度计（Mapada V-1100D）、鼓风干燥箱（DHG90A-101AS）、电子天平（岛津AOY120）和恒温摇床（安徽中科HQL150B）。

试剂为纤维复合酶（宁夏和氏璧公司）、蒽酮和甲基咪唑（上海Sigma-Aldrich公司）。细胞壁测定相关试剂均购自上海国药集团化学试剂有限公司。

1.2.1 细胞壁提取

称取0.1 g左右样品于研钵中，每份材料3个重复。加入1 mL pH 7.0的0.5 mol/L磷酸缓冲液，研磨至匀浆后，离心5 min（3 000×g），去掉上清液；沉淀加入5 mL 0.5 mol/L磷酸缓冲液淋洗2次，再用5 mL蒸馏水淋洗2次，去掉上清液；加入5 mL氯仿-甲醇（1∶1，V∶V），室温（20～35℃）下150 r/min振荡1 h后，离心5 min（3 000×g），去掉上清液；加入5 mL甲醇淋洗1次，5 mL丙酮淋洗1次，5 mL蒸馏水淋洗1次，去掉上清液；加入5 mL DMSO-H2O（9∶1，V∶V），室温振荡过夜（12 h），离心5 min（3 000×g），去掉上清液；加入5 mL DMSO-H2O淋洗2次，5 mL蒸馏水淋洗3次，去掉上清液，残渣为粗细胞壁[5]。沉淀风干至恒重，备用。

1.2.2 果胶质提取和测定

称取粗细胞壁2 mg，加入150 μL草酸铵缓冲液，在沸水中水浴l h，期间每隔10 min摇动1次，离心5 min（14 000×g），取上清液，重复3次；合并上清液至10 mL容量瓶，定容至刻度；取1 mL加入试管中，加入5 mL 0.012 5 mol/L H2SO4-硼砂，100℃沸水浴5 min；冷却后，加入100 μL 0.15%间羟基联苯溶液，振摇5 min[5]。524 nm处测定吸光度。

标准品处理：取1 mg/mL半乳糖醛酸标准溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5和0.6 mL置于10 mL容量瓶中，加水定容；分别取上述溶液1 mL加入试管，加入5 mL 0.012 5 mol/L H2SO4-硼砂，100℃沸水浴5 min；冷却后，加入100 μL 0.15%间羟基联苯溶液，振摇5 min[5]。以1 mL水为对照。524 nm处测定吸光度。以半乳糖醛酸质量浓度（mg/mL）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.3 碱溶半纤维素提取与测定

在提取果胶质后的沉淀中加入5 mL 4 mol/L KOH（含1 mg/mL NaHB4），在室温下提取1 h，期间每10 min轻轻摇动，离心5 min（14 000×g）；沉淀加入5 mL 4 mol/L KOH淋洗1次，5 mL蒸馏水淋洗2次，收集上清液，重复3次；采用蒽酮比色法测五碳糖（C5）和六碳糖（C6）[5]。620 nm比色，绘制以葡萄糖为标准样品的C6标准曲线；660 nm比色，绘制以木糖为标准样品的C5标准曲线。

1.2.4 酸溶半纤维素提取与测定4 mol/L KOH提取后的残渣用蒸馏水洗涤至中性，将残渣转移至5 mL螺口玻璃瓶，定容至2.5 mL，加入TFA裂解碱不溶半纤维素后，收集上清液，测C5和C6[5]。重复3次。

1.2.5 纤维素提取与测定

4 mol/L KOH提取后的残渣用蒸馏水洗涤至中性；将残渣转移至100 mL螺口玻璃瓶，加入4 mL 72%（ω/ω）浓硫酸，25℃摇床中150 r/min震荡1 h；取出玻璃瓶，用蒸馏水定容至10 mL，终止该反应；再定容至100 mL，取10 mL上清离心，测C5和C6[5]。

1.2.6 木质素含量提取与测定

称取0.5 g烘干后的样品，用苯-乙醇（67∶33，V∶V）抽提4 h；抽提的粉末风干后，放入250 mL三角瓶中，加入10 mL 72%（ω/ω）浓硫酸，30℃摇床中120 r/min震荡1.5 h；加入200 mL蒸馏水水解1 h[5]。将水解液用过滤器过滤，蒸馏水冲洗三角瓶3次，获得滤液；残渣用蒸馏水洗至中性。将残渣和过滤器80℃干燥至恒重，冷却至室温，称重；将残渣和过滤器以575℃灰化4 h，冷却30 min，称重。将滤液用2.88%的硫酸稀释10倍（视样品而定），紫外分光光度计比色，测定吸光值，光波长205 nm，空白为2.88%的硫酸。

计算酸溶木质素（ASL，%）、酸不溶木质素含量（AIL，%）和总木质素含量（%）。计算公式为[5]：

式中，A为吸收值；D为稀释倍数；V为滤液总体积；K为酸溶木质素的吸收系数，取110；W1为样品质量；W2为残渣和过滤器80℃干燥至恒重的重量；W3为残渣和过滤器灰化后的重量。

1.2.7 木质素单体提取与测定

称取0.05 g细胞壁粉末，加入5 mL 2 mol/L NaOH溶液、0.5 mL硝基苯，加入30 mL二氯甲烷和乙酸乙酯的混合液（1∶1，V∶V）萃取3次，保留水相；用盐酸将水相pH调至3～4，用30 mL二氯甲烷和乙酸乙酯的混合液萃取3次；收集有机相，旋蒸后的残渣用5 mL色谱甲醇重新溶解，用0.22 μm孔径滤膜过滤，取滤液上机检测[5]。HPLC检测木质素单体的条件为柱子类型universal C18反相柱（4.6 mm×250 mm）；流动相为甲醇∶水∶冰乙酸=25∶74∶1；流速为1.1 mL/min；波长为280 nm。

1.3 数据处理

采用Excel软件进行数据整理，采用SPSS 25.0软件进行方差分析和多重比较分析。

2 结果与分析

2.1 细胞壁物质组成

3种植物中的细胞壁物质组成相似，均为纤维素、半纤维素、木质素和果胶质（表1）。纤维素含量差异显著（P＜0.05），半纤维素、木质素和果胶质含量均差异极显著（P＜0.01）。蓝色叶翠云草中的纤维素、半纤维素含量均最高，木质素、果胶质含量均最低。

表1 细胞壁物质组成含量Tab.1 Contents of substance compositions of cell walls

2.2 木质素单体组成

木质素单体H、单体G和单体S含量在3种叶片中均差异极显著（P＜0.01）（表2）。小翠云木质素单体G含量高于单体S，蓝色叶和红色叶翠云草木质素单体组成均表现为单体S＞单体G＞单体H。

表2 木质素单体组成Tab.2 Compositions of lignin monomers

小翠云的木质素单体H、单体G和单体S含量均最少。木质素单体H含量表现为蓝色叶翠云草＞红色叶翠云草＞小翠云，蓝色叶翠云草的木质素单体H含量是小翠云的4.09倍。木质素单体G的含量表现为红色叶翠云草＞蓝色叶翠云草＞小翠云，红色叶翠云草的木质素单体G含量是小翠云的4.32倍。木质素单体S含量表现为红色叶翠云草＞蓝色叶翠云草＞小翠云，红色叶翠云草的木质素单体S含量是小翠云的11.82倍。

2.3 强光胁迫后细胞壁物质含量变化

红色叶翠云草和蓝色叶翠云草的纤维素含量差异显著（P＜0.05），半纤维素、木质素、果胶质、木质素单体H、木质素单体G和木质素单体S含量均差异极显著（P＜0.01）（表1～2）。红色叶翠云草的纤维素、半纤维素和木质素单体H含量均低于蓝色叶翠云草，木质素、木质素单体G、木质素单体S和果胶质含量均高于蓝色叶翠云草。

3 讨论与结论

3.1 翠云草细胞壁物质组成

纤维素是植物细胞壁中最主要的成分，含量可达40%～70%，约占植物干重的1/3[2]。半纤维素是植物细胞壁中仅次于纤维素的第2大类多糖，约占细胞壁总量的25%，其通过氢键与纤维素微纤丝交联，并与木质素、果胶质通过共价键在细胞壁基质中交联形成网络结构，共同维持细胞壁的稳定性与完整性[2，12]。木质素在植物细胞壁中广泛存在，在木本植物成熟的木质部中，其含量达18%～38%，可加强细胞壁的机械支持力和抗压强度,促进机械组织的形成，增加细胞壁硬度等[13]。本研究中，3种叶片的细胞壁物质组成均为纤维素＞半纤维素＞木质素，这3种物质之和均占细胞壁物质的90%左右，符合一般规律。

果胶质含量在初生细胞壁中约占30%，次生细胞壁中含量很少；其含有较多的多聚物，使细胞壁具有多孔性，有利于细胞壁的生长和细胞内外物质的交流[14]。本研究中，与小翠云、红色叶翠云草相比，蓝色叶翠云草的纤维素和半纤维素含量均差异显著或极显著，果胶质含量分别为小翠云和红色叶翠云草的69.59%和68.75%，差异极显著。前期研究发现，蓝色叶和红色叶翠云草的细胞壁单糖含量差异显著[11]。细胞壁单糖主要由纤维素、半纤维素和果胶质等水解而来，这种差异显著性可能与这3种成分含量变化有关。

3.2 翠云草木质素单体组成

木质素是苯丙烷类的衍生物，是由苯丙烯盐基醇转化形成的香豆醇（单体G）、松柏醇（单体S）和芥子醇（单体H）等酚类单体聚合形成的多聚物，主要出现在次生壁中[15]。木质素单体组成随产地、树种、部位、细胞类型和细胞壁层不同而变化[16]。针叶木主要含有木质素单体G，阔叶木主要含有木质素单体G和单体S，两种木材均含有少量的木质素单体H；禾本科（Gramineae）类植物的木质素主要由木质素单体G、单体S和单体H组成[17]。王健等[18]研究发现，铁皮石斛（Dendrobium officinale）茎中主要含有木质素单体G和单体S及微量的单体H。Weng等[19]发现与翠云草同属的江南卷柏（S.moellendorffii）细胞壁中含有大量木质素单体S。本研究结果表明，翠云草细胞壁木质素以木质素单体S为主，含微量的木质素单体H。同属的小翠云细胞壁以木质素单体G和单体S为主，木质素单体G含量比单体S稍高，含微量木质素单体H。说明同属的植物，其木质素单体组成存在差异。

3.3 翠云草逆境响应

研究表明，植物细胞壁中的纤维素、半纤维素、果胶质和结构蛋白等大分子物质中含有较多负电基团，可与金属阳离子发生各种物理、化学反应，将其固定于细胞壁中，减少重（类）金属对植物的毒害[20]。Zhan等[21]发现，在Pb和Cd胁迫下，华中蹄盖蕨（Athyrium wardii）为缓解毒性，其细胞壁会产生更多的果胶质和半纤维素1，提高重金属离子固定能力。Yang等[22]发现，给大豆（Glycine max）根系施加0.2～1.0 mmol/L的Cd，其根系细胞壁中的木质素含量增加。本研究中，红色叶翠云草受到强光胁迫，与蓝色叶翠云草相比，其纤维素、半纤维素和木质素单体H的含量均下降，果胶质、木质素、木质素单体S和单体G含量分别为蓝色叶翠云草的1.45、1.32、2.84和2.52倍。说明果胶质和木质素（单体S和单体G）在逆境响应中发挥更大的作用，可能与缓解重金属对植物的毒害作用相似，但还需进一步的研究证实。

本研究对翠云草细胞壁组成特性进行初步探究，为进一步挖掘翠云草蓝色叶的关键基因奠定基础。但研究还缺乏相应的分子基础，下一步工作可以结合前期研究中的转录组数据，从苯丙烷代谢途径中寻找相应的分子基础，挖掘翠云草蓝色叶的细胞壁合成关键基因。