叉头框蛋白O1 对糖尿病心肌七氟烷后处理敏感性的调节作用

罗会林，吴志林，杨芸芸

糖尿病患者的机体处于高糖、高氧化应激状态，有糖尿病的心脏病患者心肌损伤更严重，且在围术期更易发生心肌梗死，导致缺血再灌注（IR）损伤[1-2]。七氟烷后处理，即在缺血结束后、再灌注开始前即刻给予七氟烷处理，可减轻心肌IR 损伤[3-4]。研究发现，七氟烷后处理能通过抑制氧化应激、减少炎症细胞聚集、阻断细胞凋亡等实现对IR 心肌的保护[3,5-7]。然而，七氟烷后处理的这种保护效应在糖尿病心肌中不明显[5]，且原因不明。因此，寻找糖尿病心肌对七氟烷后处理不敏感的原因，有利于寻求防治糖尿病心肌IR 损伤的策略。

叉头框蛋白（Fox）转录因子是心肌中胰岛素的重要靶标，成人心脏中以FoxO1 为主[8]。FoxO1 为信号传导及转录激活因子3（STAT3）下游分子之一，可被STAT3 磷酸化失活[9]。研究表明，FoxO1 在糖尿病心肌中高表达，对其代谢产生不利影响[10]。且本研究团队前期实验发现，FoxO1高表达与糖尿病大鼠更严重的心肌IR 损伤同步发生（数据未发表），推测高水平的FoxO1 可能是糖尿病心肌对七氟烷后处理保护作用不敏感的原因。本研究拟建立糖尿病心肌IR（DM-MIR）大鼠模型，探究FoxO1 对糖尿病心肌七氟烷后处理敏感性的调节作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF 级雄性SD 大鼠（体重270～300 g），购自广东省医学实验动物中心，在武汉大学动物实验中心动物房中常规饲养。本实验经武汉大学动物实验中心伦理委员会批准（编号2021-0162）。

1.2 主要试剂和仪器

七氟烷，购自上海恒瑞医药公司；绿色荧光蛋白（GFP）标记的腺相关病毒9（AAV9-GFP）和携带FoxO1 小干扰RNA（siRNA）的绿色荧光蛋白标记的腺相关病毒9（AAV9-FoxO1 siRNA），购自上海吉玛公司；链脲佐菌素（STZ）、2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）、伊文思蓝（EB）染色液，购自美国Sigma 公司；肌酸激酶同工酶（CK-MB）、心肌肌钙蛋白I（cTnI）试剂盒、苏木素-伊红（HE）试剂、TUNEL 凋亡试剂盒，购自上海生工生物公司；FoxO1 兔单抗、凋亡相关蛋白（Fas）兔单抗、葡萄糖-6-磷酸酶（G6Pase）兔多抗、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）兔多抗，购自美国Invitrogen 公司；STAT3 兔单抗、磷酸化STAT3（p-STAT3）兔单抗、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（cleaved-caspase3）兔多抗、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1（PCK1）兔单抗、组蛋白H3 兔单抗、羊抗兔二抗，购自美国CST 公司；普通显微镜、石蜡切片机，购自德国Leica 公司；电泳和转膜装置，购自美国BioRad 公司；血糖仪，购自美国Johnson 公司；小动物呼吸机，购自上海Alcott Biotech 公司；透射电子显微镜，购自荷兰Philips 公司。

1.3 实验方法

1.3.1 DM-MIR 模型建立

选取空腹血糖水平在正常范围的90 只大鼠，如前所述[5-6]，以65 mg/kg 的剂量单次腹腔注射STZ诱导糖尿病，72 h 后通过尾静脉测定空腹血糖，空腹血糖≥16.7 mmol/L 表示糖尿病大鼠模型诱导成功。另选取18 只大鼠腹腔注射枸橼酸-磷酸氢二钠溶液，即为正常大鼠。糖尿病造模成功后正常喂养4 周，通过腹膜内注射2%戊巴比妥钠（50 mg/kg）麻醉大鼠，连接心电监测仪记录Ⅱ导联心电图。随后进行气管插管，连接动物呼吸机进行机械通气。切开大鼠胸部肌肉暴露冠状动脉左前降支（LAD），在LAD 起始部约2 mm 处用尼龙线打活结结扎30 min，观察到心尖部位心肌颜色由红色变浅或变白，且ST段向上抬高时，提示成功实现心肌缺血。心肌缺血维持30 min 后拉开活结，观察到心尖部位恢复红色且ST 段恢复则实现再灌注，持续2 h。假手术大鼠仅在LAD 穿线不结扎。

1.3.2 动物分组及给药

采用随机数字法将DM-MIR 大鼠分为DMMIR 模型组（DM-MIR 组）、DM-MIR 模型+七氟烷后处理组（DM-MIR+Sevo-PostC 组）、DM-MIR 模型+七氟烷后处理+沉默对照组（DM-MIR+Sevo-PostC+AAV9-GFP 组）、DM-MIR 模型+七氟烷后处理+FoxO1 沉默组（DM-MIR+Sevo-PostC+AAV9-FoxO1 siRNA 组），每组18 只，另外正常-假手术组（N-S组）和糖尿病假手术组（DM-S 组）各18 只。DMMIR+Sevo-PostC 组在再灌注前15 min 通过气管插管给予2%七氟烷持续吸入15 min[5-6]；DM-MIR+Sevo-PostC+AAV9-GFP 组在结扎LAD 前2 天心肌多点注射AAV9-GFP；DM-MIR+Sevo-PostC+AAV9-FoxO1 siRNA 组在结扎LAD 前2 天心肌多点注射AAV9-FoxO1 siRNA。N-S 组、DM-S 组、DM-MIR 组同步吸入氧气或注射生理盐水。免疫荧光显微镜下观察各组大鼠心肌组织GFP 分布以确认转染成功。

1.3.3 心肌梗死比例检测

再灌注2 h 时，各组随机取6 只大鼠，通过股静脉注射1% EB 染色液。10 min 后夹闭主动脉，取出心脏，-20℃冷冻30 min 后，沿纵轴切割制备心脏切片（5 个）。将切片在1% TTC 溶液中避光浸泡30 min，4%多聚甲醛中浸泡15 min，拍照。蓝色表示正常区域，红色表示缺血区域，灰白色表示梗死区域，用Image J 图像分析软件测量各切片的梗死和缺血区域面积。梗死比例（%）=（梗死和缺血区域面积/切片总面积）×100%。

1.3.4 样本采集

再灌注2 h 时，各组随机取6 只大鼠，经右颈动脉取血3 ml，静置1 h 后，4℃离心15 min 收集血清；取血后立即处死大鼠，分离心脏，取缺血区域心肌组织在4%多聚甲醛（3 只大鼠）或1%四氧化锇（3 只大鼠）中固定，前者用石蜡包埋后制备4 μm切片，后者制备透射电镜超薄（85 nm）切片。收集各组余下6 只大鼠的缺血区域心肌组织，-80℃保存。

1.3.5 血清生化指标检测

采用大鼠cTnI、CK-MB ELISA 试剂盒在自动酶标仪上测定各组大鼠的血清cTnI、CK-MB 水平。

1.3.6 HE 和TUNEL 染色

取1.3.4 心肌切片，经脱蜡、水化后，加入HE或TUNEL 试剂染色，光镜下观察各组大鼠的心肌组织形态和细胞凋亡程度。

1.3.7 透射电镜观察心肌超微结构

取电镜超薄切片，加入乙酸双氧铀和柠檬酸铅染色，在透射电镜（电压60 kV）下观察各组大鼠的心肌细胞核和肌原纤维排列等亚细胞结构。

1.3.8 蛋白免疫印迹（Western blot）检测

用试剂盒提取缺血区域心肌组织的总蛋白和核蛋白，BCA 法定量蛋白浓度。加入上样缓冲液，在沸水浴中煮5 min。取等量（30 μg）蛋白质行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，切胶并湿转至聚偏氟乙烯（PVDF）膜；5%脱脂奶粉室温封膜1 h；加入FoxO1 一抗（1: 800）、GAPDH 一抗（1:1 000）、p-STAT3 一抗（1:800）、STAT3 一抗（1:1 000）、Fas一 抗（1:1 000）、cleaved-caspase3 一抗（1:1 000）、PCK1 一抗（1:800）、G6Pase 一抗（1:500）及组蛋白H3 一抗（1:2 000），4℃孵膜过夜；次日加入羊抗兔二抗（1:2 000）孵育1 h；加入电化学发光法（ECL）发光液，用蛋白凝胶成像仪拍照。分析不同条带灰度值。

1.4 统计学方法

采用GraphPad Prism 8.0 和SPSS 25.0 软件进行统计分析，各项数据符合正态分布，以均数±标准差表示，用单因素方差分析比较多组间数据，两组间数据用SNK-q 检验比较。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血清cTnI、CK-MB、空腹血糖水平比较

与N-S 组相比，DM-S 组空腹血糖水平明显升高[（5.92±1.34）mmol/L vs.（21.35±3.17）mmol/L，P＜0.05]。与DM-S 组相比，DM-MIR 组血清cTnI[（226.14±22.35）pg/ml vs.（429.51±20.68）pg/ml]、CK-MB [（35.82±4.15）U/L vs.（124.61±9.35）U/L]水平均显著升高（P均＜0.05）。与DM-MIR 组相比，DM-MIR+Sevo-PostC+AAV9-FoxO1 siRNA 组血清cTnI[（429.51±20.68）pg/ml vs.（261.45±20.8）pg/ml]、CK-MB [（124.61±9.35）U/L vs.（48.73±8.61）U/L]、空腹血糖[（21.35±3.17）mmol/L vs.（13.95±2.84）mmol/L]水平均显著降低（P均＜0.05），DM-MIR+Sevo-PostC 组、DM-MIR+Sevo-PostC+AAV9-GFP 组上述指标的差异则均无统计学意义（P均＞0.05）。

2.2 各组大鼠心肌梗死情况（图1）

图1 各组大鼠心肌梗死情况（EB-TTC 染色）

N-S 组和DM-S 组大鼠心肌无梗死区域；DMMIR 组大鼠心肌梗死比例为（19.57±1.76）%。与DM-MIR 组相比，DM-MIR+Sevo-PostC+AAV9-FoxO1 siRNA 组心肌梗死比例降低[（19.57±1.76）%vs.（12.74±1.36）%，P＜0.05]，而DM-MIR+Sevo-PostC 组[（18.92±1.94）%]、DM-MIR+Sevo-PostC+AAV9-GFP 组[（19.63±1.85）%]心肌梗死比例差异均无统计学意义（P均＞0.05）。

2.3 各组大鼠心肌组织GFP 分布图（图2）

图2 各组大鼠心肌组织GFP 分布图（×200）

N-S 组、DM-S 组、DM-MIR 组、DMMIR+Sevo-PostC 组大鼠心肌组织均无绿色荧光。DM-MIR+Sevo-PostC+AAV9-GFP 组、DMMIR+Sevo-PostC+AAV9-FoxO1 siRNA 组大鼠心肌组织可见明显绿色荧光，提示AAV9 成功将目的序列携带至大鼠心肌组织。

2.4 各组大鼠心肌组织形态变化（图3、4）

图3 HE 染色观察各组大鼠心肌组织形态变化（×400）

N-S 组和DM-S 组大鼠心肌纤维结构清楚，分布规则，无肿胀或皱缩心肌细胞，仅有个别炎性和凋亡细胞；DM-MIR 组大鼠心肌纤维断裂、变形，分布不规则，可见肿胀或皱缩心肌细胞，有较多的炎性和凋亡细胞；DM-MIR+Sevo-PostC 组、DM-MIR+Sevo-PostC+AAV9-GFP 组大鼠心肌形态与DM-MIR 组接近；DM-MIR+Sevo-PostC+AAV9-FoxO1 siRNA 组心肌形态较DM-MIR+Sevo-PostC 组、DM-MIR+Sevo-PostC+AAV9-GFP 组规则，炎性和凋亡细胞减少。

图4 TUNEL 染色观察各组大鼠心肌组织形态变化（×400）

2.5 各组大鼠心肌超微结构变化（图5）

图5 各组大鼠心肌超微结构变化（×10 000）

N-S 组和DM-S 组大鼠心肌肌原纤维排列整齐，直线形Z 线清晰可见；细胞核呈圆形或椭圆形，可见均匀的染色质和完整的核仁。

DM-MIR 组大鼠心肌肌原纤维排列紊乱，Z 线扭曲变形，甚至断裂；细胞核呈细长或新月等形状，核膜呈卷曲状。DM-MIR+Sevo-PostC 组、DMMIR+Sevo-PostC+AAV9-GFP 组大鼠心肌肌原纤维及细胞形态与DM-MIR 组接近。

DM-MIR+Sevo-PostC+AAV9-FoxO1 siRNA 组大鼠心肌肌原纤维和Z 线趋于规则；细胞核趋于圆形等规则形状，核膜趋于光滑。

2.6 各组大鼠心肌Fas、cleaved-caspase3、PCK1、G6Pase 蛋白水平比较（图6）

图6 蛋白免疫印迹法检测各组大鼠的Fas、cleavedcaspase3、PCK1、G6Pase 蛋白水平

与N-S 组相比，DM-S 组大鼠心肌PCK1、G6Pase 蛋白水平均升高（分别为：0.17±0.04 vs.1.53±0.12；0.13±0.03 vs.1.86±0.13；P均＜0.05）。

与DM-S 组相比，DM-MIR 组Fas、cleavedcaspase3 蛋白水平均升高（分别为：0.35±0.07 vs.1.71±0.13；0.25±0.04 vs.1.42±0.08；P均＜0.05）。

与DM-MIR 组相比，DM-MIR+Sevo-PostC+AAV9-FoxO1 siRNA 组Fas、cleaved-caspase3、PCK1、G6Pase 蛋白水平降低（分别为：1.71±0.13 vs.0.74±0.11；1.42±0.08 vs.0.57±0.09；1.57±0.09 vs.0.82±0.14；1.93±0.18 vs.1.03±0.10；P均＜0.05），而DM-MIR+Sevo-PostC 组、DM-MIR+Sevo-PostC+AAV9-GFP 组上述指标的差异均无统计学意义（P均＞0.05）。

2.7 各组大鼠心肌STAT3/FoxO1 通路蛋白水平比较（图7）

图7 蛋白免疫印迹法检测各组大鼠STAT3/FoxO1通路相关蛋白水平

与N-S 组相比，DM-S 组大鼠心肌FoxO1 蛋白水平升高（0.75±0.13 vs.1.09±0.24，P＜0.05），p-STAT3/STAT3 比值降低（0.74±0.06 vs.0.59±0.05，P＜0.05）。

与DM-S 组相比，DM-MIR 组大鼠心肌FoxO1蛋白水平升高（1.09±0.24 vs.2.51±0.27，P＜0.05），p-STAT3/STAT3 比值降低（0.59±0.05 vs.0.28±0.04，P＜0.05）。

与DM-MIR 组相比，DM-MIR+Sevo-PostC+AAV9-FoxO1 siRNA 组FoxO1 蛋白水平降低（2.51±0.27 vs.1.52±0.10，P＜0.05），p-STAT3/STAT3比值无变化（0.28±0.04 vs.0.24±0.04，P＞0.05）。

3 讨论

STZ 诱导的糖尿病大鼠模型的病理环境与临床1 型糖尿病患者相似，是公认的1 型糖尿病模型[11]。本研究通过对糖尿病大鼠模型行LAD 结扎术建立DM-MIR 模型，研究FoxO1 对糖尿病心肌七氟烷后处理敏感性的调节作用。心肌梗死比例是缺血性损伤程度的直观反映[12]，而血清cTnI 水平与心肌梗死面积变化同步[13]。本研究中，DM-MIR 大鼠心肌梗死比例为（19.57±1.76）%，伴随血清cTnI、CK-MB 水平升高，且血糖水平升高，表明DM-MIR模型复制成功。研究显示，七氟烷后处理能有效保护正常大鼠的心肌IR 损伤，然而对糖尿病大鼠的心肌IR 损伤无保护作用[5]。本研究也观察到，七氟烷后处理对DM-MIR 大鼠心肌梗死比例和血清cTnI、CK-MB 水平无明显改善作用，表明七氟烷后处理对糖尿病大鼠的心肌IR 损伤无保护作用。

在非糖尿病模型中，Janus 激酶（JAK）/STAT3通路激活是后处理实现心肌保护作用的重要机制之一[14]，但糖尿病可诱导STAT3 通路传导抑制[5]。在STAT3 敲除小鼠中，1-磷酸-鞘氨醇激活JAK/STAT3 通路的心肌保护作用消失，同时FoxO1 活化增加[15]，提示活性FoxO1 蛋白水平升高可能是心肌保护失效的原因。本研究中，DM-S 组大鼠心肌中FoxO1 蛋白水平升高，p-STAT3/STAT3 比值降低，DM-MIR 大鼠心肌中FoxO1 蛋白水平进一步升高，p-STAT3/STAT3 比值进一步降低，且七氟烷后处理对上述指标均无影响，提示DM-MIR 大鼠心肌中STAT3 通路传导被抑制，且FoxO1 高表达。在糖尿病心肌中，高水平的活化FoxO1 可增加心肌细胞对脂肪酸的摄入，当摄入量超出细胞的代谢负荷时，将导致活性氧过度产生和释放、细胞能供紊乱和结构损伤[16]，同时激活氧化应激信号，破坏心肌蛋白与FoxO1 的结合[17]，损害磷脂酰肌醇-3 激酶（PI3K）/蛋白激酶（Akt）信号通路[18]。此前研究显示，减少FoxO1 表达可恢复七氟烷后处理对糖尿病患者的心肌保护作用[5]。本研究也显示，七氟烷后处理对FoxO1 蛋白和p-STAT3/STAT3 比值均无明显影响；当给予FoxO1 的siRNA 后,心肌FoxO1 蛋白水平显著降低，心肌梗死、细胞凋亡比例及血清cTnI、CK-MB 水平均显著降低，提示沉默糖尿病心肌中的FoxO1 可能为恢复糖尿病心肌七氟烷后处理敏感性的有效策略。

FoxO1 可将胰岛素、氧化应激因子、代谢物质等对细胞的刺激传递至细胞内，通过调节凋亡基因（Fas）、糖异生基因（PCK1、G6Pase）等的表达，参与调控细胞凋亡、能量代谢等生理活动[19-21]。本研究中，DM-MIR 大鼠心肌中Fas、cleavedcaspase3、PCK1、G6Pase 蛋白水平升高，提示DMMIR 大鼠心肌组织处于高凋亡和高糖异生状态。糖异生可直接造成细胞糖负荷过高[21]，还可诱导氧化损伤，启动细胞凋亡程序[22]，加重DM-MIR 损伤。而七氟烷后处理对Fas、cleaved-caspase3、PCK1、G6Pase 蛋白水平均无明显影响，但在给予FoxO1 的siRNA 后,心肌Fas、cleaved-caspase3、PCK1、G6Pase 蛋白水平及心肌梗死、细胞凋亡比例和血清cTnI 水平均显著降低，提示FoxO1 可能通过调节下游凋亡和糖异生基因表达[19-21]，影响心肌细胞凋亡和糖异生，调节糖尿病心肌对七氟烷后处理的敏感性。

综上所述，FoxO1 在DM-MIR 大鼠心肌中高表达，可能通过调节细胞凋亡和糖异生基因表达而影响糖尿病心肌对七氟烷后处理的敏感性。该研究结果可能为研发糖尿病心肌IR 损伤保护药物或药物联合应用提供潜在的作用靶点。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突