化橘红中展青霉素含量测定方法的建立 Δ

谢思敏 ，陈俊妃 ，侯惠婵 ，顾利红 ，栗建明 ，王艳慧 （.广州市药品检验所/国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室，广州 5060；.广州市香雪制药股份有限公司，广州 5055）

展青霉素（patulin）又称棒曲霉素、珊瑚青霉毒素，是一种由青霉（penicillium）、曲霉（aspergillus）、丝衣霉菌（byssochlamys）3属16种真菌产生的有毒代谢产物[1]，具有明显的基因、遗传、免疫、细胞及神经毒性[2―7]。展青霉素最先在霉烂苹果中发现[8]，而作为药食两用的山楂、红枣、乌梅、肉桂、小茴香、干姜等产品均存在展青霉素污染的现象[9―11]。针对展青霉素的污染现状及相关研究结果，各国相关部门均对其制定了限量标准，比如我国GB 2761－2017《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》规定苹果、山楂等制品中展青霉素的限量为50 μg/kg。

化橘红为芸香科植物化州柚Citrus grandis ‘Tomen‐tosa’或柚C. grandis（L.） Osbeck的未成熟或近成熟的干燥外层果皮，属于岭南地区道地药材，为“粤八味”和“十大广药”之一。该药具有理气宽中、燥湿化痰的功效，主要用于咳嗽痰多、食积伤酒、呕恶痞闷的治疗[12]。化橘红与苹果、山楂等相似，同为果实类药材，其饮片传统炮制过程为用水闷润后切丝或块，再干燥；同时也有采用新型炮制工艺的，即产地趁鲜加工与炮制一体化技术。若炮制过程操作不当或贮藏条件不规范，就容易使药材受到真菌毒素的污染，这不仅影响药材的质量，还造成一定的安全隐患，威胁患者生命健康。因此，本研究拟对化橘红药材中的展青霉素进行检测。

目前，展青霉素常用的检测方法有薄层色谱法、高效液相色谱（HPLC）法、气相色谱-质谱联用法和液相色谱-质谱联用法，其中薄层色谱法的准确性较差，HPLC法易受糠醛类物质的干扰，气相色谱-质谱联用法需要对样品进行衍生化，操作较繁琐。化橘红药材中富含多糖、黄酮、香豆素、挥发油等成分，基质复杂，而液相色谱-质谱联用法分离能力强、检测限低、灵敏度高，适用于复杂基质中展青霉素的检测[11]。因此，本研究采用高效液相色谱-串联三重四极杆质谱联用（HPLC-MS/MS）法测定化橘红中展青霉素的含量，以期为化橘红外源性有害物质残留控制的研究提供参考。

1 材料

1.1 主要仪器

LCMS-8050型超快速HPLC-MS/MS仪（包括LC-30AD型二元泵、SIL-30AC型自动进样器、CTO-40C型柱温箱等）购自日本Shimadzu公司；AG245型十万分之一电子分析天平购自瑞士Mettler-Toledo公司；Milli-Q超纯水处理系统购自德国Merck Millipore公司；T25型高速匀浆仪购自德国IKA公司；ST16型高速离心机购自美国Thermo Fisher Scientific公司；N-EVAP型氮吹仪购自美国Organomation公司。

1.2 主要药品与试剂

展青霉素对照品溶液（批号S056149，质量浓度100 μg/mL）、SHIMSEN 228型固相净化柱（适用于展青霉素，批号S19121306）均购自日本Shimadzu公司；果胶酶（批号SLBT6394）购自美国Sigma公司；无水硫酸镁-无水醋酸钠（4∶1，m/m）混合粉末（批号623831112A）购自美国Waters公司；乙酸、乙腈均为色谱纯，水为超纯水。20批化橘红药材饮片收自3个产地，均经广州市药品检验所侯惠婵主任中药师鉴定为真品（样品信息见表1）。

表1 20批化橘红样品信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为岛津Shim-pack XR-ODS（3.0 mm×75 mm，2.2 μm）；流动相为水（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～5 min，5%B；5～5.1 min，5%B→40%B；5.1～6.5 min，40%B；6.5～6.6 min，40%B→95%B；6.6～10 min，95%B；10～10.1 min，95%B→5%B）；流速为0.3 mL/min；柱温为25 ℃；进样量为5 μL。

2.2 质谱条件

采用电喷雾离子源（electron spray ionization，ESI），以负离子模式进行分析；脱溶剂管温度为526 ℃，加热模块温度为400 ℃，接口温度为300 ℃；雾化气流速为3 L/min，干燥气流速为10 L/min，加热气流速为10 L/min。采用多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）模式，选择质荷比（m/z）153.3→80.9、m/z 153.3→109.2的离子对为检测离子对，碰撞电压分别为14、13 V。

2.3 对照品溶液的制备

精密量取展青霉素对照品溶液1 mL，置于10 mL容量瓶中，加乙腈稀释至刻度，制成质量浓度为10 μg/mL的溶液，作为展青霉素对照品贮备液。精密量取该贮备液1 mL，置于10 mL容量瓶中，用2%乙腈（用乙酸调节pH值至2）稀释至刻度，制成质量浓度为1 000 ng/mL的对照品溶液，即得。

2.4 供试品溶液的制备

取化橘红样品粉末（过二号筛）约4 g，精密称定，置于具塞离心管中，加水30 mL溶散，加果胶酶75 μL，混匀，40 ℃下放置2 h，精密加入乙腈60 mL，高速匀浆2 min（转速10 000 r/min），离心10 min（转速4 000 r/min）。取上清液20 mL，加入无水硫酸镁-无水醋酸钠（4∶1，m/m）混合粉末1.5 g，充分振摇2 min，离心10 min（转速4 000 r/min）。取上清液9 mL通过固相净化柱，收集净化液，混匀。精密量取5 mL，置带刻度试管中，加入乙酸50 μL，40 ℃条件下用氮气吹至近干，以2%乙腈溶液（用乙酸调节pH值至2）定容至1 mL，涡旋混匀，用微孔滤膜（0.22 μm）滤过，取续滤液，即得。其总离子流图见图1A。

图1 化橘红中展青霉素含量测定的总离子流图

2.5 系列基质对照品溶液的制备

取空白基质样品（序号12，由预实验结果得知该样品不含展青霉素）4 g，按“2.4”项下方法处理至“40 ℃条件下用氮气吹至近干”，分别精密加入“2.3”项下展青霉素对照品溶液5、10、20、50、100、150、200 μL，再用2%乙腈溶液（用乙酸调节pH值至2）定容至1 mL，涡旋混匀，用微孔滤膜（0.22 μm）滤过，取续滤液，即得质量浓度分别为5、10、20、50、100、150、200 ng/mL 的系列基质对照品溶液。其总离子流图见图1B。

2.6 线性关系考察

取“2.5”项下系列基质对照品溶液，按“2.1”“2.2”项下条件进样测定，记录峰面积。以峰面积（Y）对基质对照品的质量浓度（X）进行线性回归，绘制标准曲线，权重系数设为1/x，可得线性回归方程为Y＝9 152.74X－12 285.2（r＝0.999 6）。结果表明，展青霉素的检测质量浓度在5～200 ng/mL 范围内与峰面积成良好的线性关系。

2.7 灵敏度试验

按“2.5”项下制备不同质量浓度的展青霉素基质对照品溶液，按“2.1”“2.2”项下条件进样测定，以信噪比（S/N）为3时测得的量作为检出限，S/N＝10时测得的量作为定量限。结果显示，其定量限为6 μg/kg，检出限为3 μg/kg。

2.8 精密度试验

精密吸取“2.5”项下基质对照品溶液（质量浓度为50 ng/mL）5 μL，按“2.1”“2.2”项下条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果显示，峰面积的RSD为1.83%（n＝6），表明该方法精密度良好。

2.9 重复性试验

称取同一批样品（序号12），每份约4 g，精密称定，平行6份，分别置于具塞离心管中，精密加入“2.3”项下展青霉素对照品贮备液60 μL，按“2.4”项下方法制备供试品溶液。分别精密吸取5 μL，按“2.1”“2.2”项下条件进样测定，记录峰面积并以外标法计算样品含量。结果显示，样品含量的RSD为5.28%（n＝6），表明该方法重复性良好。

2.10 加样回收率试验

称取同一批样品（序号12），每份约4 g，精密称定，置于具塞离心管中，分别精密加入“2.3”项下展青霉素对照品贮备液12、60、120 μL，每个水平平行3份，分别作为低、中、高3个浓度水平的加样回收试验样品。按“2.4”项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取5 μL，按“2.1”“2.2”项下条件进样测定，计算加样回收率，结果见表2。

表2 展青霉素的加样回收率试验结果（n＝3）

2.11 稳定性试验

取“2.10”项下的供试品溶液，分别于制备后0、2、6、12 h按“2.1”“2.2”项下条件进样测定，记录峰面积。结果显示，峰面积的RSD为5.82%（n＝4），表明供试品溶液在制备后12 h内稳定性良好。

2.12 样品测定

取20批化橘红样品各适量，分别按“2.4”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”“2.2”项下条件进样分析，记录峰面积并以外标法计算样品含量。结果显示，20批样品均未检出展青霉素。

3 讨论

3.1 流动相的选择

流动相的种类和比例会对目标化合物的离子化效率产生影响，从而影响测试方法的灵敏度。展青霉素对热稳定，在酸性条件下化学性质稳定，在碱性条件下易降解[13]。本研究考察了不同流动相系统（包括0.1%甲酸溶液-乙腈、水-乙腈、水-甲醇）对展青霉素质谱响应的影响。结果表明，流动相系统中加入甲酸后，可明显降低展青霉素的离子化效率，使仪器灵敏度显著下降，故0.1%甲酸溶液-乙腈不适合用于展青霉素的测定；而后两种流动相系统均可获得较好的质谱响应，但乙腈相对于甲醇的黏度更小，相应的系统压力也更小，故本研究选择水-乙腈作为流动相。

3.2 色谱柱的选择

展青霉素易溶于水，极性大[14]，在C18色谱柱上的保留弱。鉴于此，本研究考察了Aglient ZORBAX Eclipse Plus C18（2.1 mm×100 mm，1.8 µm）、Phenomenex Kine‐tex C18（100 mm×2.1 mm，2.6 µm）、岛津 Shim-pack GIST（100 mm×2.1 mm，2 μm）、岛津 Shim-pack XRODS（3.0 mm×75 mm，2.2 μm）几种色谱柱对展青霉素的分离效果。结果表明，岛津Shim-pack XR-ODS色谱柱的碳载量高，可以增强展青霉素在色谱柱上的保留，延迟其出峰时间，使其与其他大极性杂质有效分离，避免杂质对测定的干扰和共流出峰的抑制效应，故本研究最终选择岛津Shim-pack XR-ODS色谱柱。

3.3 前处理方法的优化

孟瑾等[15]研究发现，对山楂样品进行果胶酶酶解处理可明显提高方法的回收率。这是由于大分子果胶质对展青霉素有包裹作用[1]，仅采用物理和化学提取方式不能完全把展青霉素提取出来，还需同时采用生物提取法，以提高提取和测定方法的准确度。同理，化橘红中含有大量果胶，因此本研究在化橘红样品粉末加水溶散后，进行了果胶酶酶解处理，以尽可能多地提取出展青霉素。

本研究对提取溶剂也进行了考察，比较了乙腈和甲醇的提取效果。结果表明，酶解后的样品经甲醇提取后的溶液颜色明显深于乙腈提取液，同时甲醇提取液在加入无水硫酸镁-无水醋酸钠（4∶1，m/m）混合粉末固相分散萃取后不分层，无法达到除去大量色素及大极性化合物的目的，最后得到的供试品溶液对展青霉素会产生明显的基质抑制效应，影响测定的准确性和灵敏度，故本研究采用乙腈作为提取溶剂。同时，本研究还考察了无水硫酸镁-无水醋酸钠（4∶1，m/m）混合粉末在1.5 g和3.0 g不同加入量条件下对净化效果和实验准确度的影响，结果表明没有明显差异，故本研究选择无水硫酸镁-无水醋酸钠（4∶1，m/m）混合粉末的加入量为1.5 g。

展青霉素固相净化柱是一种直接通过式的杂质吸附型固相萃取柱。样品溶液直接上样后，该净化柱可将杂质吸附于柱体上，从而降低基质杂质对测定结果的影响。随着杂质斑带在柱体上的延伸，后续溶液的颜色逐渐变深而最终对样品的净化效果产生影响，因此除杂时应避免上样体积过大而出现过载现象；同时，由于溶液在柱体上有部分的吸附损失，经综合考虑，本研究最终确定上柱溶液的体积为9 mL。此外，展青霉素在酸性环境中的稳定性较好，而其溶液蒸干后形成的薄膜则不稳定[1]。本研究将通过展青霉素固相净化柱后的净化液在40 ℃条件下用氮气吹至近干，并在使用氮气前加入50 μL乙酸溶液，可增强展青霉素在整个浓缩过程中的稳定性，同时使溶液在近干状态下不容易被完全吹干，从而提高实验的可操作性。但由于化橘红中展青霉素的含量测定为痕量残留分析，且样品的前处理过程比较复杂，这造成了在低浓度加样水平的回收率差异较大。

4 结语

本研究所收集的20批化橘红药材饮片均未检出展青霉素，提示不管是采用产地趁鲜加工与炮制一体化技术处理的药材饮片（序号1～5），还是采用传统闷润法炮制的药材饮片（序号6～20），均不会造成化橘红在加工过程中受到展青霉素污染。本研究所建方法可实现对化橘红中展青霉素的快速筛查和准确定量，为化橘红的安全性研究和质量控制提供实验依据和方法。