基于SERS的过氧化氢检测法及在发酵液中甘油含量监测中的应用

张法楠， 刘传志， 李柏志， 李鸿睿， 侯 玥

(1. 长春理工大学 生命科学技术学院， 长春 130022； 2. 吉林大学 药学院， 长春 130021)

过氧化氢(H2O2)是需氧生物中常见的天然代谢产物[1], 该化合物一直被认为是氧化代谢的有害副产物[2]. 近年来， H2O2和相关活性氧(reactive oxygen species， ROS)参与动、 植物生理功能的研究受到人们广泛关注[1]. H2O2还在许多(病理)生理条件下产生自由基ROS， 并参与体内氧化还原过程的调节[3]. 目前， H2O2的研究涉及许多生物过程的前沿， 如细胞增殖和分化、 组织修复、 炎症、 昼夜节律的中心氧化还原信号传导分子和老化[4]等.

对H2O2代谢和信号传导的观察， 要求具有高灵敏的可靠测量[5]， 但目前测定H2O2的方法均非常耗时[6-7]. 比色试剂盒法用辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)催化H2O2， 以3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine， TMB)为底物改变吸光度值定量H2O2[8]. 虽然HRP具有高度的特异性， 但检测的灵敏度仍不能满足需要.

毕赤酵母是一种广泛使用的重组蛋白生产宿主， 毕赤酵母前期以甘油为碳源， 当毕赤酵母生长达到预定指标时， 可将甘油耗尽， 便进入以甲酵作为唯一碳源的蛋白表达阶段. 因此， 实验中及时掌握甘油耗尽点， 可为添加甲醇进行蛋白表达提供准确信息[9-12]. 目前的甘油检测方法是将甘油-3-磷酸氧化酶(glycerol 3-phosphate oxidase, GPO)等物质的量氧化成甘油-3-磷酸和H2O2， 再利用HRP将 H2O2分解成H2O和O-， 导致色原氧化变色， 通过颜色变化计算H2O2浓度.

表面增强Raman光谱(surface-enhanced Raman scattering， SERS)广泛应用于超灵敏的生物测定平台, 如测量微生物、 特异性抗体、 适体、 肽和核酸等[13-20]. Li等[21]研究了SERS基于Au 纳米粒子及靶向肽的修饰探针， 该探针创建了一个金-硒界面， 与线粒体中H2O2反应并定位, 该探针在生物条件下对丰富的硫醇表现出良好的耐受性， 并且在活细胞中监测线粒体 H2O2的性能优越， 实现线粒体 H2O2的原位定量， 并获得其真实的氧化应激下时间动态变化； Jiang等[22]研究了一种基于沸石咪唑酯骨架-8(ZIF-8) 的SERS传感器， 通过将ZIF-8与活性金纳米粒子(AuNPs)结合作为响应探针， 检测活细胞释放的H2O2， 由于SERS优越的指纹识别和ZIF对H2O2的高效富集和选择性响应， 该方法对H2O2检测表现出较高的抗干扰能力， 检测限低至0.357 nmol/L， 由于AuNPs和ZIF的成功整合提高了催化活性， 响应时间可缩短至1 min， 证明了SERS传感器在快速检测H2O2方面的有效性； Cheng等[23]构建了一种新型硼酸(BA)纳米探针对H2O2含量进行定量表征， 其中将金纳米棒修饰的对硫醇苯硼酸(4-MPBA)报告分子(AuNRs)用于Raman信号增强. 结果表明， 合成的AuNRs/4-MPBA/BA 纳米探针在H2O2含量的测量灵敏度方面具有明显优势, 对应的线性范围和检出限为分别为0.5～2×103μmol/L和0.15 μmol/L, 回收率和相对标准偏差分别约为96%和6%.

TMB底物氧化可产生具有强烈SERS活性的产物TMB2+. HRP催化H2O2的反应中， 可将SERS惰性的发色反应物TMB氧化成SERS活性产物TMB2+. TMB2+的SERS信号随H2O2浓度增加在一定范围内呈线性增加[24]. 本文利用纳米金(AuNP)可增强Raman信号的特征[25]， 通过将纳米金粒子(AuNP， 60 nm)水溶液引入样品中， 使用SERS方法定量检测不同浓度的H2O2， 根据文献[24]确定在1 338,1 605 cm-1处的Raman峰是TMB2+的SERS特征峰. 采用SERS基于HRP催化H2O2氧化TMB的反应及AuNP的Raman增强信号作用， 实现H2O2的微量定量分析. 根据酵母发酵中甘油可等物质的量氧化成甘油酸和H2O2的原理， 通过检测H2O2浓度对酵母培养液中甘油浓度的微量变化进行了定量分析， 并与商品试剂进行比较. 结果表明， 甘油检出限LOD=2.75 μmol/L, 酵母培养液中甘油消耗的速度与酵母增值呈正相关. 微量的甘油分析可及时掌握甘油耗尽点， 提高了检测即时甘油的灵敏度和效率， 为蛋白诱导表达提供准确信息.

1 实 验

1.1 仪器与试剂

IX71型Raman显微镜(RM， 日本OLYMPUS公司)； ONLAB-EU2000型分光光度计(上海昂拉仪器有限公司)； ISO Planesct 320型激光发生器和冷却电荷耦合器(-70 ℃， 瑞典Cobolt公司， 功率30 mW)； Tecnai G2 Spirt Biotwin型透射电子显微镜(美国FEI公司)； bioflo 310型发酵罐(7.5 L, 美国NBS公司). 3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB, 上海沪试化工公司)； 辣根过氧化物酶(HRP, 日本TOYOBO公司)； 纳米金(AuNP， 60 nm, 苏州桓球科技公司)； 毕赤酵母(吉林大学药学院现代生物学教研室)； 甘油检测试剂盒(爱尔兰Megazyme公司)； 甘油-3-磷酸氧化酶(GPO， 美国Sigma公司)； TMB储存液(湖州英创生物科技有限公司);φ=30%的H2O2、 柠檬酸和磷酸氢二钠(上海沪试化工公司)； 0.5 mol/L H2SO4和10 mmol/L磷酸盐缓冲液(厦门英科新创科技有限公司); 其他试剂均为国产分析纯试剂.

上罐种子培养液组成： YPD培养基， 每升培养液中含φ=0.5%的甘油，φ=2%的胰化蛋白胨，φ=1%的酵母提取物. 上罐发酵培养液组成：φ=85%的H3PO46.67 mL, CaSO4·2H2O 0.23 g, K2SO44.55 g, MgSO4·7H2O 3.72 g, KOH 1.03 g, 甘油 10 g, 加入双蒸馏水至1 L， 高压灭菌. 实验用水均为双蒸馏水.

1.2 H2O2检测方法建立及应用

1.2.1 H2O2标准液制备

委托吉林省正恒检测有限公司， 先将φ=30% H2O2用高锰酸钾标定， 再稀释成浓度为88，44，22，11，5.5，2.75，1.37 μmol/L的溶液， 2～8 ℃储存备用.

1.2.2 TMB显色液配制

取25 mmol/L TMB储存液0.125 mL， 0.1 mol/L柠檬酸2.5 mL， 0.2 mol/L磷酸氢二钠2.5 mL， 双蒸水5 mL， 混合， 于2～8 ℃避光储存备用.

1.2.3 过氧化物酶(HRP)试剂配制

用pH=7.4的10 mmol/L磷酸盐缓冲液将HRP配制成100 U/L的溶液(其中U定义为每分钟转化1 μmol底物需要的酶量)， 于2～8 ℃保存备用.

1.2.4 H2O2的ELISA检测法

分别取88，44，22，11，5.5，2.75，1.37 μmol/L H2O2各200 μL， 然后加入TMB显色液50 μL， 100 U/L HRP 20 μL， 于37 ℃反应20 min， 各孔加入0.5 mol/L H2SO450 μL. 用分光光度计于400～600 nm分别扫描测量各浓度H2O2的吸光度(Abs)值.

1.2.5 H2O2的SERS检测方法建立

分别取88，44，22，11，5.5，2.75，1.37 μmol/L H2O2各200 μL， 然后加入TMB显色液50 μL， 100 U/L的HRP 20 μL， 于37 ℃反应20 min， 各孔加入0.5 mol/L H2SO450 μL和AuNP(60 nm)50 μL.

在H2O2测量过程中， 分别对H2O2+TMB+HRP， H2O2+TMB+HRP+H2SO4和H2O2+TMB+HRP+H2SO4+AuNP在波长1 300～1 800 cm-1内进行SERS扫描. 同时采用透射电子显微镜对AuNP的均一程度进行观察.

检测在反射模式下进行， 使用633 nm激发激光(激光功率为5%)， 1 800线/mm光栅和冷却的电荷耦合器件(-70 ℃). 10倍物镜发出激光束并收集反向散射光， 以5 s的积分时间进行测量. 在每个SERS区域的10个位置进行测量， 并对数据取平均值. 使用WiRE 3.2(雷尼绍软件)进行背景校正和曲线拟合. 在进行曲线拟合前， 先通过六阶多项式拟合将光谱减去背景.

将浓度为88，44，22，11，5.5，2.75，1.37 μmol/L 的H2O2标准液分别加入TMB，HRP，H2SO4和AuNP中， 在波长1 300～1 800 cm-1内进行SERS扫描检测， 每个样品分别检测10次， 数据经SPSS 19.0统计软件分析. 根据实验数据计算SERS检测方法的重复性(CV)； 根据不同浓度H2O2的Raman信号强度确定该方法的检测限(LOD)及线性范围； 将2.75，5.5 μmol/L的H2O2进行加标， 使其理论背景值分别达到5.5，11.0 μmol/L， 进行加标回收率(%)实验.

1.2.6 发酵液中甘油的SERS定量分析

实验采用SERS检测方法对不同发酵时间发酵液中甘油浓度的变化进行定量分析. 采用7.5 L发酵罐, 酵母上罐前进行灭菌， 冷却至30 ℃时在上罐发酵培养液中按5%的体积分数投入菌液， 转速600 r/min， 通气量10 L/min， 调节pH=5.5, 培养12 h. 分别在0，6，12 h取样检测甘油浓度, 观察氧溶(dissolved oxygen， DO)值和OD600值变化. SERS检测样品中GPO和 HRP分别为1.0，10 U/mg.

1.2.7 发酵液中SERS分析H2O2的干扰实验

酵母发酵培养液由5.67 g H3PO4, 0.23 g CaSO4·2H2O, 4.55 g K2SO4, 3.72 g MgSO4·7H2O, 1.03 g KOH和10 g甘油组成. 预先将培养液制备成原液、 体积比为1∶1和1∶2的溶液， 采用SERS检测方法对3种不同浓度培养液中的H2O2进行平行3次检测. 观察在培养液中各物质变化对H2O2检测的影响.

2 结果与讨论

2.1 H2O2的比色检测(ELISA法)

在H2O2存在的情况下, HRP可将无色的底物分子TMB氧化成蓝色氧化物TMB2+(图1(A)). 加入强无机酸(如H2SO4)可终止反应， 产生黄色的TMB2+(图1(B))， 可见低pH值条件有利于形成双电子产物. 通过分光光度计对电荷转移复合物和TMB2+进行定量可得到一种方便的检测方法. 图2为TMB2+的氧化产物在不同浓度H2O2中的显色效果. 图3为不同浓度H2O2检测的线性关系. 由图3可见， 随着H2O2浓度的降低， 450 nm处的吸光度降低， 检出限LOD=5.5 μmol/L.

图1 TMB氧化反应原理(A)和TMB氧化后的颜色变化(B)

图2 不同浓度H2O2显色的可见光谱分析

图3 不同浓度H2O2检测的线性关系

2.2 H2O2的SERS光谱分析

SERS检测中常采用金或银纳米颗粒作为Raman信号增强子. 金属纳米颗粒可导致平均光散射增强104～106倍[25-26]. 这种增强的电磁场由纳米粒子表面电子激发所致， 被称为局部表面等离振子共振(LSPR). LSPR是由纳米粒子的电子响应于入射光的振荡导致电子波共振状态. LSPR在LSPR峰值的波长处产生强烈的纳米粒子吸收和散射， 可提高SERS测定的灵敏度[27-28].

AuNP和纳米银(AgNP)均具有较强的Raman信号增强作用. 由于氧化还原反应易导致AgNP氧化， 其稳定性较差， 因此本文选择AuNP作为Raman信号增强子. 由于不同AuNP尺寸的增强作用、 粒子的均匀程度间存在差异， 经实验对比后， 采用苏州桓球科技公司生产的60 nm AuNP作为Raman信号增强子， 电镜照片如图4所示.

图4 60 nm AgNP电镜照片

分别将AuNP，H2O2+TMB+HRP，H2O2+TMB+HRP+H2SO4和H2O2+TMB+HRP+H2SO4+AuNP进行分组检测， 在波长1 300～1 800 cm-1内进行SERS扫描， 结果如图5所示. 各组中只有H2O2+TMB+HRP+H2SO4+AuNP组在1 605 cm-1具有Raman强度信号改变， 显示其特异性峰值.

图5 过氧化物酶催化H2O2至TMB氧化反应的SERS光谱

2.3 H2O2的SERS定量分析

分别向浓度为88，44，22，11，5.5，2.75,1.37 μmol/L 的H2O2标准液中加入TMB，HRP，H2SO4和AuNP， 在波长1 300～1 800 cm-1内进行SERS扫描检测， 每个样品分别检测10次， 取平均值， 结果如图6所示. 由图6可见， 随着H2O2浓度的降低， 1 605 cm-1处的Raman强度逐渐降低. 因为H2O2浓度为1.37 μmol/L时Raman信号重复检测中具有较大差异， 所以将检出限确定为LOD=2.75 μmol/L. 当H2O2浓度为2.75～22 μmol/L时， 其与Raman信号强度的自然对数具有线性关系，R2=0.995， 检测的线性曲线如图7所示.

图6 不同浓度H2O2的SERS定量分析

图7 不同浓度的H2O2与Raman强度自然对数的线性关系

SERS定量分析H2O2数据经SPSS 19.0统计软件分析， 其平均CV=5.38%， 平均回收率=96.05%， 结果列于表1. 实验表明， SERS方法比ELISA方法检测H2O2浓度的LOD值降低一倍， 且灵敏度更高[29-31].

表1 SERS定量分析H2O2浓度的精密度(n=10)

2.4 发酵液中甘油的SERS 定量分析

实验利用酵母发酵液中甘油在GPO和HRP的作用下等物质的量氧化成甘油酸和H2O2的原理， 通过检测H2O2浓度， 对酵母培养液中甘油浓度的微量变化进行定量分析. 实验采用SERS检测H2O2的方法对0，6，12 h培养液中的甘油浓度进行测量， 同时对比培养期间的DO和OD600值. 结果如图8所示. 由图8可见： 随着培养时间的增加， 酵母持续繁殖， 甘油逐渐耗尽， OD600值增高； DO值在对数生长期下降明显， 至对数生长期末期出现最低值， 而在发酵后期， 由于菌体衰老， 呼吸强度减弱， 因此DO值逐渐上升， 符合酵母培养的生长规律. 表明SERS检测甘油的方法可在酵母培养过程中快速、 准确监测培养液中甘油的消耗情况.

图8 不同发酵时间发酵液中甘油浓度的SERS定量分析(A)， DO值(B)和OD600值(C)变化

2.5 发酵液中SERS法检测H2O2的干扰实验

因酵母的生长需求， 通常酵母培养液中会含有多种无机盐和甘油. 实验通过在不同浓度培养液中添加5.5，11.0 μmol/L H2O2， 观察培养液成分变化对甘油检测的干扰程度， 结果列于表2. 由表2可见， 不同浓度培养液中的各种无机盐和甘油浓度变化对检测无明显干扰作用.

表2 不同浓度培养液中H2O2的SERS检测结果(n=3)

综上所述， 本文设计了一种H2O2定量分析方法. 通过利用过氧化物酶活性， 在H2O2存在下催化底物TMB的反应， 生成最终产物TMB2+， 在Raman增强分子AuNP的共同作用下， 获得较敏感的SERS信号， 实现了H2O2定量分析. 实验观察到TMB2+的SERS检测信号的自然对数， 在H2O2浓度为2.75～22 μmol/L内呈线性增加， 检出限LOD=2.75 μmol/L，R2=0.995， 平均CV=5.38%， 平均回收率为96.05%. 通过对发酵液中甘油的SERS定量分析， 表明该方法具有较高的灵敏度、 精密度和准确性， 在较短时间内实现了对H2O2的定量分析.