水稻DUF761基因家族的鉴定及在非生物逆境中的表达分析

张应新，盛锋，杜雪竹，胡琴

(湖北大学生命科学学院， 湖北 武汉 430062)

0 引言

我国是一个农业大国，农业安全和粮食安全对维持社会稳定，保障人民利益，推动国家发展具有重要的意义[1-2].水稻(OryzasativaL.)是我国最重要的粮食作物，水稻高产、优质、绿色是育种家追求的重要目标.近年来，因为农业生态环境的日益恶化、耕地面积减少、极端气候多发等因素，对水稻生产造成了重大的损失[3].干旱、高温、盐害等非生物逆境是限制水稻高产、稳产的主要因素[4-6].进一步挖掘和鉴定水稻抗逆相关基因资源，结合分子育种技术，推动水稻抗逆品种(系)的开发与培育，对保障水稻产业的绿色可持续发展具有重大的意义.

未知功能域蛋白(Domain of unknown Function，DUF)是一大类功能尚未被表征的蛋白家族，目前在蛋白家族 Pfam(http://pfam.xfam.org/)数据库中已收录超过5 000种含有DUF结构域的蛋白家族，约占所有已知蛋白家族的27%[7].随着分子生物学研究方法的不断创新，大量未知功能基因被分离鉴定，其生物学功能也得到了初步验证.但是，即便是拟南芥、水稻等模式植物，也依旧有着大量功能未知的基因.近年来，迅速发展的基因组学和蛋白质组学的为研究DUF家族基因功能提供了有力的生物学信息支撑，有关DUF参与植物生长发育和逆境应答方面的研究报道越来越多，表明DUF家族在植物生命活动中发挥着重要的调控作用[8].

模式植物拟南芥和水稻中的研究表明，大量DUF基因家族在植物响应非生物逆境胁迫中发挥重要作用.Xin等发现，拟南芥DUF231家族成员ESK1(At3g55990)负调控植物对冷胁迫的适应性，该基因突变后对冷胁迫的耐受性明显增强，且不依赖于传统的冷适应机制[9].在拟南芥中超量表达DUF966基因家族成员AtAuxRP3(At3g46110)后，转基因材料表现出叶片畸形、花序异常等生长素异位积累相关表型；进一步研究发现转基因拟南芥中生长素含量增加，下游生长素响应相关基因表达量也明显上调表达，同时对NaCl和渗透胁迫更加敏感，表明AtAuxRP3可能通过调控生长素的合成以及信号转导协同调控植物的生长发育以及对非生物逆境的抗性[10].Yang等对拟南芥DUF4228基因家族进行非生物胁迫诱导表达模式分析以及互作蛋白研究时发现，几乎所有的拟南芥DUF4228基因成员都不同程度受到非生物逆境胁迫(NaCl、冷和干旱胁迫)的诱导差异表达，且在部分基因在地上和地下部分的表达模式存在明显差异；蛋白互作实验证实部分DUF4228成员能够与已报道的非生物逆境调控因子发生互作，如AT1G21010和AT1G29195能够与PP2A互作[11-13], AT1G28190能够与WRKY15和ATL6互作[14], AT1G76660能够与WRKY40和CML38互作[15]，暗示拟南芥DUF4228蛋白可能通过上述逆境调控因子参与植物对非生物胁迫的应答[16].在水稻中，Luo等发现水稻DUF966基因家族成员OsDSR2显著受到盐、干旱、高温等逆境胁迫诱导下调表达，OsDSR2超表达的转基因水稻对高盐和干旱胁迫的耐受性明显降低，抗逆相关基因如OsNCED4、SNAC1、OsbZIP23的表达量也显著减少[17].Cui 等发现超量表达水稻DUF1 645家族成员OsSGL能够显著提高转基因水稻对干旱的耐受性，转基因材料中脯氨酸和可溶性糖含量明显增加，丙二醛含量降低，转录组数据也表明在超量表达材料中逆境响应相关基因明显上调表达，说明OsSGL正向调控水稻对干旱胁迫耐受性[18].以上研究结果表明，DUF基因家族在植物响应非生物逆境胁迫中发挥重要作用，且相关成员通常会在转录水平上对各种胁迫做出响应，为利用反向遗传学的研究方法筛选植物非生物逆境相关基因提供了便利.

DUF761基因家族起源于裸子植物并广泛存在于维管植物中.近年来在棉花纤维细胞中发现一类新的微丝结合蛋白GhCFE1，该结合蛋白含有DUF761和DUF4408结构域,超量表达该基因后出现抑制棉纤维细胞的起始和伸长[19]，这两个结构域均可在拟南芥DUF761家族中发现，但其具体的生物学功能尚未可知.本研究利用生物信息学的研究方法对 DUF76家族进行了系统的分析同时结合非生物逆境诱导表达模式鉴定水稻中与非生物逆境响应相关的DUF761成员，为后续进一步开展DUF761基因功能研究奠定基础.

1 材料与方法

1.1 数据搜索和OsDUF761基因的鉴定以“DUF761”为关键词在国家水稻数据库RGAP(http://rice.plantbiology.msu.edu/)中检索水稻DUF761基因成员并下载其DNA序列、编码区序列和蛋白质序列以及染色体位置.分别使用在线分析软件ExPASyProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)对OsDUF761s蛋白质理化性质进行分析；利用CELLOv.2.5(http://cello.life.nctu.edu.tw/)和PSORT(https://psort.hgc.jp/)软件进行亚细胞定位预测.

1.2 水稻DUF761的染色体定位以及蛋白质进化分析从RGAP database下载OsDUF761家族成员的物理位置信息并绘制染色体物理定位图.分别从RGAP database和中TAIR(https://www.arabidopsis.org)下载水稻和拟南芥 DUF761家族成员蛋白质序列，利用MEGA6.0软件，采用 NJ (neighbor-joining)法构建系统进化树.

1.3 水稻DUF761基因结构和蛋白质功能结构域分析从RGAP database中下载水稻DUF761的基因组信息以及外显子-内含子分布数据，利用GSDS 2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)绘制DUF761家族基因结构分布图.利用在线软件Pfam(http://pfam.janelia.org/)进行蛋白质保守域分析.

1.4 水稻DUF761基因启动子顺式作用元件分析利用RGAP database获取了7个OsDUF761基因 (起始密码子ATG)上游序列的1 500 bp基因组片段作为启动子区段，通过在线分析软件PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)进行OsDUF761家族成员启动子顺式作用元件分析.

1.5 植物材料与处理本研究选用野生型日本晴水稻幼苗进行非生物胁迫研究来明确OsDUF761基因家族逆境胁迫应答机制.具体操作参照本实验室前人研究进行[20].

1.6 RNA提取与反转录利用Eastep® Super Total RNA Extraction试剂盒(Promega)抽提上述试验叶片总RNA，具体步骤参照说明书进行.RNA于-80 ℃超低温冰箱保存备用.利用Go ScriptTMReverse Transcription Kit (Promega) 进行cDNA合成，cDNA于-20 ℃冰箱保存备用.RT-qPCR分析利用qPrimerDB-qPCR Primer Database(https://biodb.swu.edu.cn/qprimerdb/)设计RT-qPCR引物，以Ubiquitin7(UB7, LOC_Os03g13170)作为内参基因，引物序列如表2所示.参照Power Up SYBR Green Master Mix(Applied Biosystems)试剂盒说明书，于CFX ConnectTMReal-Time System(BIO-RAD)进行RT-qPCR反应,并采用 2-ΔΔCT计算基因的相对表达水平.

2 结果与分析

2.1 水稻DUF761鉴定以7个拟南芥DUF761蛋白为探针，在水稻全基因组(Oryzasativa)中共检索到7个编码包含DUF761结构域的水稻OsDUF761成员，进一步利用 Pfam 数据库搜索 DUF761 结构域证实这7个成员都属于DUF761 家族，并将这些基因命名为OsDUF761.01～OsDUF761.07.对其基因和蛋白质序列进行初步分析发现，OsDUF761所编码的蛋白质含有696～1 002个氨基酸残基，相对分子量为25.50～36.66 kD，等电点为3.87～10.2.蛋白亚细胞定位预测结果显示部分OsDUF761蛋白在两种软件(CELLO v.2.5和PSORT)下的预测结果有明显差异，其中OsDUF761.01和OsDUF761.07定位于质膜，OsDUF761.02定位于线粒体内膜或叶绿体类囊膜，OsDUF761.03定位于质膜或细胞核，OsDUF761.04定位于质膜或细胞质，OsDUF761.05和OsDUF761. 06定位于质膜或叶绿体类囊体膜(表1).亚细胞定位预测结果表明水稻DUF761蛋白有着非常复杂的亚细胞定位，但是均含有生物膜定位信号，暗示其生物学功能可能依赖其膜定位特征实现.

表1 水稻DUF761s基因的序列特征

亚细胞定位，“A”和“B”表示分别通过软件CELLO v.2.5(http://cello.life.nctu.edu.tw/)和PSORT(https://psort.hgc.jp/)预测蛋白的亚细胞定位的结果；P.M：质膜；Nucl：细胞核；Cyto：细胞质；C.t.m：叶绿体类囊体膜；M.t.m：线粒体内膜.

2.2 OsDUF761家族基因染色体定位从RGAP database中获取OsDUF761s的物理位置信息，分析发现7个OsDUF761基因分别定位于3、 6、7、8、10和12号染色体上.除12号染色体上含有2个OsDUF761基因外，其他染色体上均只含有1个OsDUF761基因(图1).

图1 OsDUF761s基因在水稻染色体中定位和分布情况

2.3 水稻和拟南芥DUF761家族进化树分析为更加直观地了解DUF761蛋白的进化关系，利用MEGA 6.0软件对水稻和拟南芥DUF761蛋白进行亲缘关系分析，发现拟南芥和水稻DUF761 蛋白成员可以划分为3个亚族(Ⅰ～Ⅲ).其中AT2G26110与OsDUF761.01、OsDUF761.04、OsDUF761.05、OsDUF761.06和OsDUF761.07属于亚族Ⅰ；AT5G54300、AT1G61260、AT1G11210、AT1G11220、AT1G11230与OsDUF761.03属于亚族Ⅱ； AT4G04990、AT1G15385与OsDUF761.04属于亚族Ⅲ(图2).

2.4 水稻DUF761家族基因结构和蛋白结构域分析进一步我们获取了RGAP database中OsDUF761s的基因序列、编码区(CDS)序列和蛋白序列.基因结构分析显示，OsDUF761s基因结构相似，均只含有一个外显子(图3).蛋白质保守结构域预测显示，OsDUF761家族成员大多含有2个保守的DUF761结构域(图4).上述结果说明OsDUF761家族成员在基因结构以及蛋白质保守结构域在进化上较为保守.

图2 水稻和拟南芥DUF761蛋白系统进化树

图3 水稻OsDUF761s基因结构

图4 OsDUF761s蛋白质保守结构域分析

图5 水稻DUF761s家族启动子区域分析

2.5 水稻DUF761家族顺式作用元件分析为进一步分析水稻OsDUF761s可能参与的生理过程，我们RGAP database获取了OsDUF761s基因的启动子序列，并对其所含的顺式作用元件进行预测分析.如图5所示，除ProOsDUF761.02、ProOsDUF761.07外，其余ProOsDUF761s均含有厌氧诱导响应元件(A)和不同类型的光响应元件，说明这两类顺式作用元件在ProOsDUF761s中保守存在.各个ProOsDUF761均含有多个逆境相关转录因子结合元件(M、R、L、和K)、防御和逆境响应元件(P)、低温响应元件(J)或缺氧响应元件(H)；ProOsDUF761.03、ProOsDUF761.04、ProOsDUF761.05和ProOsDUF761.06含有干旱诱导相关MYB结合元件(L)；ProOsDUF761.01、ProOsDUF761.03、ProOsDUF761.04和ProOsDUF761.05含有WRKY转录因子结合元件(I)；ProOsDUF761.02和ProOsDUF761.04含有逆境胁迫响应元件(P)；ProOsDUF761.01和ProOsDUF761.02和ProOsDUF761.04含有低温响应元件(J).与植物激素响应相关的顺式元件有3类，ProOsDUF761.01、ProOsDUF761.02和ProOsDUF761.05含有水杨酸响应元件(Q)；ProOsDUF761.03、ProOsDUF761.04、ProOsDUF761.06和ProOsDUF761.07含有茉莉酸甲酯响应元件(G)；ProOsDUF761.01、ProOsDUF761.03、ProOsDUF761.04和ProOsDUF761.06脱落酸响应元件(A).由此可见，每个ProOsDUF761启动子含有不同功能的顺式作用元件，说明它们可能通过不同的信号通路参与多种环境胁迫反应.

图6 OsDUF761基因在10% PEG、4 ℃和NaCl处理下的表达模式分析

图7 OsDUF761基因在脱水胁迫处理下的表达模式分析

2.6 OsDUF761s基因的非生物逆境表达模式分析为进一步验证顺势作用元件预测的准确性，同时明确OsDUF761s基因家族在水稻抵御非生物逆境胁迫中应答机制，我们利用qRT-PCR分析7个OsDUF761在PEG、低温、NaCl以及脱水胁迫下的诱导表达模式(图6、图7).OsDUF761.01在水稻苗期本底表达水平非常低，且在4种非生物逆境下都未能检测到表达水平，因此对其表达模式不进行探讨.采用qPrimerDB-qPCR Primer Database设计RT-qPCR引物(表2)，以水稻OsActin(LOC_Os03g50885)为内参基因进行RT-qPCR分析.结果表明，OsDUF761.02在PEG和NaCl处理下表达水平较低，与Mock无明显差异；但是显著受到低温诱导上调表达，在低温处理24 h与Mock相比上调倍数达195.2倍.

表2 用于RT-qPCR分析的OsDUF761s基因和内参基因的引物列表

OsDUF761.03在NaCl和低温处理下先诱导上调达到峰值后逐渐下降至本底水平，其中在NaCl处理1 h与Mock相比诱导上调表达倍数最为显著达34.3倍，在低温处理6 h与Mock相比诱导上调表达倍数最为显著达12.9倍；总体表现受NaCl和低温处理诱导上调表达，对PEG处理无明显响应.OsDUF761.04在PEG和NaCl处理下与Mock相比无明显差异，仅在个别时间点有明显的上调表达，PEG处理下在1 h 和 12 h分别上调17.6倍和33.3倍，NaCl处理下在1 h上调18.5倍；在低温处理下呈现出明显的上调表达(6 h)再下调(12 h)再上调(24 h)的表达模式，在6 h 和24 h上调表达倍数为14.5和85.8倍；总体表现受PEG、NaCl和低温处理诱导上调表达，且对低温处理响应最显著.OsDUF761.05在PEG处理下与Mock相比无明显差异；在NaCl处理下仅在12 h 有明显的下调表达，下调倍数约为3.5倍；在低温处理下表现出先上调(3 h)再下调(12 h)再上调(24 h)的表达模式，其中在6 h和24 h上调表达倍数较高达48.9倍和62.6倍；总体表现对PEG和NaCl处理不明显，受低温处理显著诱导上调表达.OsDUF761.06在PEG处理下表达模式较为复杂，先上调再下调再上调表达；但是差异表达倍数均在2倍左右；在NaCl处理下先上调表达然后逐渐降低至本底水平，在 1 h表达差异最大，差异倍数达4.4倍；在低温处理下明显下调表达，在 6 h表达量下调最为明显，差异倍数达9.6倍；总体表现为对PEG和NaCl处理响应不明显，有略微上调表达，但受低温处理显著诱导下调表达.OsDUF761.07在PEG处理下表现出先上调然后降低到本底水平的表达模式，但是对PEG处理响应不显著，在3 h差异倍数最大为2.6倍；受 NaCl处理下显著下调表达，在12 h下调倍数最为显著达7.6倍；在低温处理整体表现为下调表达，仅在24 h 表达量有略微上调，在12 h下调倍数最为显著达5.8倍，总体表现为受PEG处理诱导略微上调表达，受NaCl和低温处理诱导下调表达.

在脱水胁迫下，OsDUF761.03、OsDUF761.04和OsDUF761.05表现出受脱水胁迫诱导上调表达的趋势.其中OsDUF761.03在脱水处理6 h表达水平达到峰值上调倍数为17.9倍，OsDUF761.04在脱水处理3 h上调表达最为显著，差异倍数达243倍，OsDUF761.05在脱水处理12 h表达量上调最为显著达10.2倍；其余基因如OsDUF761.02、OsDUF761.06和OsDUF761.07均有不同程度受脱水胁迫诱导下调表达，其中OsDUF761.07下调表达最为显著，在12 h下调倍数为61.8倍，OsDUF761.02在12 h下调倍数为19.1倍，OsDUF761.06在3 h下调倍数为2.4倍.

3 讨论

水稻是我国重要的粮食作物，在农业生产中占有举足轻重的地位.保障水稻的高产稳产，对维护社会安定和粮食安全具有重要意义.随着社会经济的快速发展、全球人口的持续增长，粮食安全问题日益凸显.此外，由于全球气候变化导致极端天气频繁发生以及农业生态环境的日益恶劣，进一步加剧了粮食安全问题.植物对环境胁迫的抗性有着复杂的遗传和分子基础，形成了精细且严密的分子网络调控对逆境的感知、信号转导、抗性相关物质积累以及抗性“记忆”等方面，最终在形态、生理和生化水平上发生一系列改变以抵御逆境[21].近年来，随着功能基因组学的迅速发展，有关DUF基因的功能报道越来越多，也揭示了其在植物生长发育和逆境响应中的重要调控作用[22].DUF761基因家族起源于裸子植物并广泛存在于维管植物中.在模式植物拟南芥中的研究表明，含有DUF761结构域的DUF761-1基因(At4G16790)可能参与了植物防御反应以及细胞壁形态建成.超量表达该基因会导致植物叶片形态、花序以及角果形态异常，同时对丁香假单胞菌抗性增强[23].

目前，在水稻中尚无DUF761家族成员的功能报道.基于DUF761基因家族在植物生长发育和逆境胁迫响应中的重要功能，本研究对水稻DUF761基因家族成员及其可能参与的逆境响应进行了初步的研究，为进一步探讨OsDUF761基因在水稻响应非生物胁迫中的功能提供了实验依据.在水稻中鉴定出7个DUF761基因(OsDUF761.01-OsDUF761.02)，分布在水稻3、6、7、8、10和12号染色体上；来源于拟南芥和水稻的DUF761蛋白系统发育树表明， DUF761蛋白在进化上能够分为3个亚类，并且每一个亚类中都包含单、双子叶植物的DUF761蛋白，说明DUF761蛋白的基本特征在单、双子叶植物分化之前已经形成.基因结构和蛋白质保守结构域分析表明，OsDUF761s基因结构类似，均只有1个外显子，其编码蛋白包含有1～2个保守的DUF761结构域，进一步说明了DUF761成员间在进化和功能上的保守性.OsDUF761s亚细胞定位预测结果表明，大多数OsDUF761蛋白都具有生物膜(细胞膜、线粒体膜、叶绿体膜等)定位特征，暗示其功能可能与生物膜相关生理生化过程有关.

非生物胁迫诱导基因的表达受其上游启动子顺式作用元件及转录因子的调控，对基因启动子区段所含有的顺式作用元件进行分析，能够初步预测该基因可能参与的胁迫响应[24].在本研究中，利用PlantCARE对7个OsDUF761基因的启动子区段(ProOsDUF761)进行顺式作用元件分析发现，OsDUF761启动子区段所含有的顺式作用元件可以分为3类.一类是与直接与非生物胁迫相关的顺式作用元件，包括光响应元件Box4(F)和G-Box(I)、厌氧诱导元件ARE(D)、低温响应元件LTR(J)和胁迫响应元件TC-rich repeats(P)；第二类是参与胁迫相关激素响应的顺式作用元件，包括脱落酸响应顺式作用元件ABRE(A)、茉莉酸甲酯响应顺式作用元件TGACG-motif(H)、水杨酸响应顺式作用元件TCA-element(Q)；第三类是胁迫相关转录因子结合顺式作用元件，包括干旱诱导MYB结合位点MBS(K)、MYB转录因子结合元件(L)、MYC转录因子结合元件(M)、WRKY转录因子结合元件W box(R).这些非生物逆境相关顺式作用元件在OsDUF761s启动子区域的广泛存在暗示OsDUF761s基因可能在水稻响应非生物胁迫中发挥着重要的调控作用.因此，本研究对OsDUF761s基因在PEG、4 ℃、NaCl和脱水胁迫下的时空表达模式进行了分析.结果表明，6个OsDUF761s基因在PEG、4 ℃、NaCl和脱水胁迫下都有不同程度的差异表达，尤其是.在PEG处理下，只有OsDUF761.04和OsDUF761.07有不同程度的的上调表达；但是在脱水胁迫下，OsDUF761.04受脱水胁迫显著诱导上调表达，OsDUF761.07受脱水胁迫显著诱导下调表达，说明OsDUF761.04和OsDUF761.07在水稻响应渗透胁迫和极端干旱中存在明显的功能分化，且水稻体内存在不同的机制去调控OsDUF761.04在OsDUF761.07的表达以区分响应这两种胁迫类型.我们还发现除OsDUF761.02只对低温和脱水胁迫有明显响应外，其余成员对低温、NaCl和脱水胁迫下均有明显的差异表达，说明OsDUF761基因家族成员主要参与水稻对低温、NaCl和脱水胁迫等胁迫的抗逆调控.其中OsDUF761.03受NaCl处理诱导上调表达最为显著，OsDUF761.07受NaCl处理诱导下调表达最为显著；OsDUF761.02受低温处理诱导上调表达最为显著，OsDUF761.06受低温处理诱导下调表达最为显著；OsDUF761.04受脱水处理诱导上调表达最为显著，OsDUF761.07受脱水处理诱导下调表达最为显著.上述基因可以作为后续研究重点进一步解析其在水稻抵御非生物逆境中的生物学功能，并为利用基因工程改良水稻的抗逆能力提供基因资源和参考依据.

4 结论

基于DUF761基因家族在植物生长发育和非生物胁迫响应中的重要作用，本研究鉴定出水稻中共有7个DUF761s基因，并对水稻DUF761s基因家族的染色体定位、进化树、基因结构和蛋白功能结构域进行了分析；对水稻DUF761s基因家族启动子顺式作用元件进行了预测；对水稻DUFs家族基因在多种非生物胁迫下表达模式进行了检测，为后续研究水稻DUFs家族响应非生物胁迫的分子机制提供理论基础，为进一步研究水稻DUF761的功能提供了参考.