过继性T细胞治疗在非小细胞肺癌中的研究进展*

颜次慧 任秀宝

T 细胞是获得性抗肿瘤免疫的重要细胞亚群。T细胞通过其表面的T 细胞受体（T cell receptor，TCR）特异性识别主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）分子与肿瘤抗原形成的MHC-抗原肽复合物（peptide-MHC complex，pMHC），启动针对肿瘤细胞的特异性杀伤功能。TCR 包括αβ和γδ 两种异源二聚体，其中TCRαβ 占TCR 总量的95%以上。TCR 以非共价键与CD3 二聚体CD3γε、CD3δε 和CD3ζζ 形成TCR-CD3 复合物。通过CD3 亚基的免疫受体酪氨酸激活基序（immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM），TCR 活化信号向下游传递，T 细胞活化、增殖，并分泌炎症因子（IL-2、TNF-α、IFN-γ）、杀伤因子（穿孔素、颗粒酶）以及死亡配体（TNF 相关凋亡诱导配体TRAIL 和FasL），从而导致肿瘤细胞裂解死亡，并引发旁观者免疫反应。然而，肿瘤往往处于免疫逃逸状态。这种状态，一方面是由于具有肿瘤特异性识别能力的T 细胞无法浸润至肿瘤内部（冷肿瘤）；另一方面是即使T 细胞进入肿瘤内部，由于TCR 信号的反复刺激和免疫抑制微环境的影响，导致T 细胞免疫检查点等免疫抑制分子的表达升高，分泌细胞因子的功能下降，细胞走向耗竭[1]。免疫检查点抑制剂能够逆转耗竭T 细胞前体细胞，使其再次活化发挥抗肿瘤免疫功能，但仅对少数肿瘤患者有效。寻找提高T 细胞数量、增强其抗肿瘤功能的新型免疫治疗方法是目前抗肿瘤免疫治疗研究的难点与热点。

过继性T 细胞免疫治疗通过体外富集、扩增肿瘤特异性T 细胞，将其回输至自体患者体内，以达杀伤肿瘤的目的。扩增的T 细胞既可来自于肿瘤浸润淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocytes，TILs）,也可来自经基因改造的外周血T 细胞，如嵌合抗原受体T 细胞（chimeric antigen receptor T-cell，CAR-T）、T 细胞受体工程化T 细胞（T-cell receptor engineering T cell，TCR-T）。过继性T 细胞治疗最早应用于同种异体造血干细胞移植治疗白血病，能够显著降低患者复发率。自1998年开展TILs 治疗转移性恶性黑色素瘤的临床研究，2006年以黑色素瘤抗原-1（melanoma antigen recognized by T cells 1，MART-1）作为靶抗原的TCRT 用于恶性黑色瘤治疗。2008年，以CD20 作为靶标的CAR-T 在惰性B 细胞淋巴瘤和套细胞淋巴瘤治疗中显现潜在治疗效果。近年来，在消化道肿瘤、脑胶质瘤等实体肿瘤中报道了过继性T 细胞疗法[2-3]。多项过继性T 细胞治疗非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）的临床试验也正在招募或开展当中。本文将对TILs、CAR-T、TCR-T 细胞治疗NSCLC 的最新进展进行综述，重点阐述各种治疗方法面临的挑战和今后潜在发展策略，以期为优化临床研究设计和开展新型NSCLC 免疫治疗提供思路。

1 过继性T 细胞的生物学特征

1.1 TILs

TILs 是存在于肿瘤微环境中的异质性免疫细胞群体。在免疫抑制的肿瘤微环境中，抗原提呈细胞难以浸润至肿瘤组织内部，而且肿瘤细胞MHC-I 分子表达缺失，造成肿瘤抗原提呈受抑，TILs 难以激活。即使肿瘤抗原被提呈至T 细胞，由于PD-1、TIM3 等免疫检查点分子表达上调诱导了免疫抑制信号，TILs仍不能被有效活化，或是在刚活化后即发生活化诱导的细胞凋亡，或向耗竭转变[1]。TILs 包含的肿瘤特异性T 细胞比例远高于外周血等其他非肿瘤组织，TILs具有多克隆型，且更大比例的靶向主干（truncal）新抗原，是理想的过继性T 细胞治疗的细胞来源[4]。TILs一旦脱离免疫抑制微环境，在TCR 活化信号与细胞因子的联合作用下，可大量扩增至1010，满足临床细胞回输的要求[5]。TILs 扩增方案主要包括3 个步骤：1）使用高浓度IL-2 从肿瘤组织中富集TILs；2）鉴定筛选肿瘤特异性反应的TILs；3）快速大量扩增筛选后的TILs（图1）。整个TILs 分离扩增过程需要6～8 周。

1.2 CAR-T

CAR-T 是经基因改造使特异性抗原识别特征改变的T 细胞。CAR-T 细胞无MHC 限制性，拓宽了基因改造T 细胞的应用范围。CARs 是一段合成的融合蛋白，由胞外靶抗原结合域、铰链区、跨膜结合域、胞内信号转导结构域4 部分构成。胞外靶抗原结合域由抗原特异性单克隆抗体scFv （重链和轻链可变区通过柔性接头连接构成的单链可变片段） 构成。ScFv与抗原表位的亲和力特征是影响CAR 识别抗原、激活T 细胞的重要指标。铰链区位于胞外，为来源于免疫球蛋白、CD28、CD8 的多肽片段，其功能是克服空间位阻，以利于scFv 与抗原表位结合。跨膜结合域的作用是将CAR 锚定在T 细胞膜上，也影响CAR 表达水平、稳定性及胞内信号转导。胞内信号转导结构域在CAR 结合抗原表位时直接启动T 细胞活化。

CAR-T 的发展过程伴随着CARs 胞内区结构的不断改进与优化（图2）。第一代CARs 的胞内区仅包含CD3ζ 链，增殖活性低，细胞毒性作用持续时间短。为克服这此缺点，第二和三代CARs 在胞内区增加了1 或2 个共刺激分子（CD28、4-1BB、ICOS、CD27、OX40 和DAP10）[6]。第四代CARs 旨在对CAR-T 进行调节，如增加自杀基因以减少肿瘤清除后CAR-T细胞对正常组织的损伤，或增加诱导IL-12、IL-15 等细胞因子生成的基因，以增强CAR-T 的杀伤功能和体内长期生存能力[7]。随着传统CRISPR-Cas9 系统以及新型编辑方法在CARs 设计中的应用，下一代CARs 将更加精准地将治疗和调控基因插入至特定基因位点，生产更加安全、有效、生存持久、以及应用通用型的CAR-T[8]。目前临床获批以及临床试验中应用最多的为第二代CARs，少量第三代CARs 也已进入临床研究阶段。2017年，美国食品药品监督管理局（FDA）批准首个CAR-T 细胞疗法。2021年，中国相继批准2 款针对CD19 抗原的CAR-T 疗法。

1.3 TCR-T

TCR-T 的制备过程包括：鉴定筛选具有良好抗肿瘤反应的T 细胞，克隆其TCR，并插入逆转录或慢病毒载体，利用病毒感染待回输患者的外周血T 细胞，扩增T 细胞，进行回输。肿瘤相关抗原包括组织分化抗原（tumor associated antigen，TAAs）、癌症-睾丸抗原（cancer-testis antigens，CTAs）、基因突变产生的肿瘤新抗原（neoantigens）、病毒抗原、表观改变的抗原以及存在于非转化的肿瘤血管和间质的抗原。肿瘤新抗原仅在肿瘤中表达，CTAs 在特定肿瘤中表达，且只在睾丸、胎盘等少数免疫豁免的正常组织中表达。因此，肿瘤新抗原和CTAs 又称为肿瘤特异性抗原（tumor specific antigens，TSAs）。

TAAs 是早期最常用使用的TCR-T 靶抗原，如癌胚抗原（CEA），黑色素细胞分化抗原PMEL（gp100）、MART-1、酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白1 和2 等。但由于TAAs 也在正常组织中少量表达，因此在发挥抗肿瘤作用的同时往往导致脱靶效应。NY-ESO-1属于CTAs，其在多种肿瘤组织中表达，正常组织中仅有睾丸组织表达，是肿瘤免疫治疗的理想靶抗原。与以TAAs 作为靶标的TCR-T 比较，NY-ESO-1-TCRT 治疗导致的严重不良反应发生率显著降低，NYESO-1 已成为目前TCR-T 临床研究最常用的靶抗原之一[9]。

TILs 来自肿瘤组织的多克隆型T 细胞群体，CAR-T 和TCR-T 的抗原特异性来自基因改造，三者密切关联，针对TILs 新抗原和特异性克隆型的筛选为开展CAR-T 和TCR-T 的研究奠定了坚实基础。

2 过继性T 细胞治疗在NSCLC 中的临床应用

2.1 TILs

根据NSCLC 肿瘤与间质部位TILs 的分布密度，将NSCLC 的免疫亚型分为炎症型、免疫豁免型、免疫沙漠型3 类，分别占44.0%、37.1%、18.9%[10]。NSCLC 的TILs 中包含肿瘤特异性T 细胞[11]。NSCLC患者肿瘤取材较为方便可行。31%～40% 的晚期NSCLC 患者可能发生锁骨上转移，40%以上的患者可能发生胸膜转移，通过穿刺或胸腔镜即可获取肿瘤组织。而且，65%的晚期NSCLC 患者肺CO 弥散容量≥50%，能够耐受TILs 回输前的非清髓性淋巴细胞清除预处理以及回输中和之后的高剂量IL-2 持续给药。以上条件为TILs 应用于NSCLC 治疗提供了前提条件。

目前，TILs 应用于NSCLC 治疗的研究较少，已在Clinicaltrial.gov 注册的临床研究包括：NC T03215810、NCT03903887、NCT02133196、NCT0461 4103、NCT03645928、NCT04919616。一项晚期NSCLC 患者在nivolumab 单药治疗进展后接受TILs 联合nivolumab 的1b 期单臂临床研究（NCT03215810），共纳入20 例患者，严重不良反应发生率低于17%，13例患者可进行疗效评估（客观反应3 例），共11 例患者肿瘤负荷下降，中位最佳肿瘤缩小率35%[12]。TILs中存在识别肿瘤突变的特异性T 细胞，且此特异性T细胞在对治疗反应的患者来源的TILs 中比例较高；TILs 回输后，特异性T 细胞在外周血的比例增加，且可长期存在[12]。回输“年轻”状态TILs 可提高抗肿瘤疗效，但对NSCLC 的作用尚待研究。以上结果表明TILs 联合PD-1 抗体治疗晚期NSCLC 的可行性，显示潜在抗肿瘤作用，有望成为转移性肺癌的治疗新策略。

2.2 CAR-T

CARs 以MHC 非限制性的方式识别表面抗原，除表面抗原外，CARs 还能识别糖类和糖脂。将条件性调控信号活化和清除CARs 的反应元件加入CARs 结构中可在保证CAR-T 疗效的同时降低不良反应的发生。针对CD19 的CAR-T 已在血液肿瘤中取得成功，但CAR-T 治疗实体肿瘤仍面临挑战。

目前处于肺癌CAR-T 细胞基础研究和临床试验阶段的靶抗原包括表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）、人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）、间皮素（mesothelin，MSLN）、前列腺干细胞抗原（prostate stem cell antigen，PSCA）、黏蛋白1（mucin 1，MUC1）、CEA、酪氨酸激酶样孤儿受体1（receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 1，ROR1）、PD-L1和CD80/CD86。EGFR 属于生长因子受体酪氨酸激酶ErbB 家族成员。EGFR 在NSCLC 原发肿瘤和转移灶中高表达，是抗体依赖的免疫治疗的重要靶点。在一项二代EGFR-CAR-T 治疗复发和难治EGFR 阳性NSCLC 患者的Ⅰ期临床研究（NCT01869166）中，共入组11 例患者，所有患者未发生严重不良反应，并均进行了疗效评价，其中2 例部分缓解和5 例疾病稳定患者维持时间达2～8 个月[13]。基因修饰T 细胞多采用逆转录或慢病毒感染的方式将外源基因插入T细胞基因组中。在一项利用PiggyBac（PB）转座子制备EGFR-CAR-T 的Ⅰ期临床研究（NCT03182816）中，共纳入9 例EGFR 阳性的晚期复发或难治性NSCLC患者，中位无病生存和总生存时间分别为7.13 个月和15.63 个月，结果表明经PB 转座子系统修饰改造EGFR-CAR-T 细胞治疗EGFR 阳性NSCLC 患者安全可行，值得进一步研究[14]。HER2 也是CAR-T 肺癌治疗的潜在靶点，但1 例个案报道结肠癌转移至肺和肝脏患者在接受HER2-CAR-T 回输15 min 内发生呼吸窘迫症，与正常肺上皮表达HER2 相关[15]。MSLN是细胞黏附糖蛋白，促进肿瘤侵袭转移。MSLN 在60%的肺腺癌中表达，但不表达于正常肺组织[16]。在一项MSLN-CAR-T 治疗晚期恶性肿瘤的Ⅰ期临床研究（NCT01583686）中，纳入肺癌、胰腺癌、恶性间皮瘤、宫颈癌和卵巢癌患者共15 例，严重不良发生率为40%（6/15），1 例维持疾病稳定达3.5 个月。多项MSLNCAR-T 治疗肺癌的临床研究（NCT02414269、NCT-02580747）正在进行中。MUC1 为跨膜糖蛋白，PSCA 为糖基磷脂酰肌醇锚定细胞表面蛋白，两者均在NSCLC中高表达。针对PSCA联合MUC1的CAR-T治疗NSCLC PDX 小鼠模型，显示协同抗肿瘤作用[17]。目前尚无两者临床研究结果的报道。CD80/CD86 与CTLA4 结合阻断T 细胞活化，CD80/CD86 在肺癌细胞中表达，是解除T 细胞早期活化抑制的理想靶分子。然而，CD80/CD86 也表达于免疫细胞。因此，使用靶向CD80/CD86 的CAR-T 可能导致自体免疫损伤。

2.3 TCR-T

目前，TCR-T 临床治疗研究涉及的肿瘤包括肺癌、宫颈癌、鼻咽癌、头颈部肿瘤、乳腺癌、尿路上皮癌等。作为靶蛋白的肿瘤相关靶抗原包括MAGE-A4、NYESO-1、KK-LC-1 等，针对病毒相关肿瘤的治疗多采用EBV、HPV E7 和E6 抗原。

NY-ESO-1 免疫原性高且表达特异，是肺癌TCRT 治疗研究最多的靶抗原。NY-ESO-1 在NSCLC 中的表达率为11.8%～28.1%，且远处转移和Ⅲ～Ⅳ期患者肿瘤组织NY-ESO-1 的表达高于非远处转移和Ⅰ～Ⅱ早期患者[18]。一项研究招募了4 例HLA-A2阳性转移NSCLC 患者，肿瘤组织均表达NY-ESO-1，接受非清髓性淋巴细胞清除预处理后回输NY-ESO-1 特异性HLA-A2 的TCR-T，并皮下注射IL-2 维持14 天，患者耐受良好，未出现严重不良反应，2 例患者对治疗有反应（NCT02457650）[19]。其他TCR-T 治疗NSCLC 的临床研究正在进行中（NCT03029273、NC T02588612、NCT03778814、NCT04639245、NCT051 94735、NCT03970382）。

TILs、CAR-T、TCR-T 治疗NSCLC 各具优势。在临床及转化研究中，需深入探索疗效与不良反应发生的预测标记物，筛选患者进行适合的过继性T 细胞治疗，以达最佳疗效。

3 过继性T 细胞治疗的困境与未来方向

CAR-T 和TCR-T 均以特定抗原为靶点，可能造成脱靶效应及严重不良反应发生，而且不同瘤种间和肿瘤内部的异质性、免疫编辑和抗原逃逸机制往往导致针对单一靶标治疗效果差。CAR-T 的肿瘤浸润能力较差，难以进入实体肿瘤内部发挥功能。CAR-T 引起的细胞因子释放综合症（cytokine-release syndrome，CRS）、神经毒性和严重感染可能危及生命[20]。TCRT 的内源性TCRα、β 链竞争外源TCR，使具有肿瘤特异性的外源TCR 在T 细胞表面的表达量较低，T 细胞难以有效活化[21]。今后的研究将重点聚焦在选择新因子扩增TILs、利用高通量测序鉴定、筛选肿瘤新抗原特异性TILs；寻找最佳CAR-T 和TCR-T 靶抗原、动态监测靶抗原表达、优化外源基因表达；过继性T细胞联合免疫调节因子等方面。

4 结语与展望

虽然过继性T 细胞在NSCLC 治疗中的研究起步较晚，但临床研究结果显示了初步疗效和潜在治疗前景。未来过继性T 细胞治疗将向个体化、精准化和新型联合治疗方向发展，以期在提高疗效的同时避免脱靶效应和严重不良反应发生，使过继性T 细胞真正成为治疗NSCLC 的有利工具。