人源性肾癌异体移植模型的建立及分析

李锦楠 崔亮 肖旭仁 吴学杰 代晓飞 李景敏

传统的移植瘤模型是把人体肿瘤细胞或鼠源性肿瘤细胞通过体外筛选稳定的细胞系，然后将其注射到不同程度的免疫缺陷的小鼠皮下组织或者原位从而构建稳定的移植瘤模型。连续传代的肿瘤细胞通常无法适应外界环境，导致原代肿瘤丧失了异质性，因此不能精准判断原始肿瘤的生物学特征[1]。目前，最准确的模型是病人来源的肿瘤异种移植物(patient derived xenografts，PDX)，将术后取下的新鲜肿瘤组织块移植到存在免疫缺陷的小鼠上，已被证明适用于多种癌症，包括膀胱癌，乳腺癌，胰腺癌，肺癌，结肠癌，肝癌以及黑色素瘤[2-8]。这些模型反映了原始肿瘤的异质性，在体外实验无法重现的原位肿瘤基质间的相互作用。研究表明这样的方法是适合在免疫缺陷的小鼠体内发展RCC PDX模型[9-10]。PDX模型的最突出的优点是保留了临床病人肿瘤的特点：主要体现在原始肿瘤的组织学特征和病人肿瘤特有的基因组特征以及原始肿瘤的异质性，均高度保存在PDX模型移植瘤中[10]。PDX模型移植瘤也包含从临床病人来源的肿瘤基质、免疫细胞及肿瘤生长微环境[10]。目前，PDX肿瘤模型有可能是目前具有临床相关性较好的癌症模型，其在预测的药物作用平台方面上升到了一个新的高度，能够更加准确的概括病人治疗的疗效。为了分析肿瘤的生物学特点，我们以肾癌病人新鲜肾癌组织为标本来源进行移植，构建小鼠移植瘤模型，进行观察。

材料与方法

一、材料

用于建立模型的新鲜肾癌组织手术标本来源于我院泌尿外科病人，术前诊断均为肾癌，病人编号1，65岁，男，肿瘤直径7 cm×7 cm×5.5 cm，病理类型为肾透明细胞癌，无瘤栓，无肉眼血尿；病人编号2,29岁，女，肿瘤直径8 cm×7 cm×6 cm，病理类型为肾实质内多形性上皮样细胞肿瘤，无瘤栓，无肉眼血尿；病人编号3,67岁，男，肿瘤直径2.1 cm×1.8 cm×1.5 cm，病理类型为肾透明细胞癌，无瘤栓，无肉眼血尿；病人编号4,65岁，男，肿瘤直径5.5 cm×7 cm×5 cm，病理类型为肾透明细胞癌，有瘤栓，无肉眼血尿；病人编号5,70岁，女，肿瘤直径3.8 ×3.5 ×3.5 cm，病理类型为肾透明细胞癌，无瘤栓，无肉眼血尿；病人编号6,60岁，男，肿瘤直径6 cm×6 cm×4.5 cm，病理类型为肾透明细胞癌，无瘤栓，有肉眼血尿；病人编号7,61岁，男，肿瘤直径5.8 cm×5.5 cm×5 cm，病理类型为肾透明细胞癌，无瘤栓，无肉眼血尿。术中标本切除后，立即放入0 ℃含10%的胚牛血清的DMEM培养基中，运送至实验室，所构建的移植瘤模型肿瘤组织，术后常规病理诊断为肾癌。应用NOD-SCID小鼠：该小鼠是NOD小鼠和SCID(severe combined immunodeficiency)小鼠杂交后得到的，其中SCID小鼠是非肥胖型糖尿病或重症联合免疫缺陷小鼠，是在prkdcscid基因位点发生纯合子基因突变形成的，T细胞和B细胞丧失基本功能，并且NOD小鼠的巨噬细胞存在功能缺陷、补体和NK细胞功能降低。本实验所用的NOD-SCID小鼠均是在SPF条件下饲养的6～8周雌/雄小鼠。

二、方法

1、肾癌PDX NOD-SCID小鼠皮下移植瘤模型的建立：6～8周龄的NOD-SCID小鼠饲养在SPF级屏障环境中，适应环境不少于3天。将从手术室获得的肾癌手术标本，放入冰浴的含10%的胎牛血清的DMEM培养基里。运送至实验室，在超净台内，将冰DMEM培养基倒掉，加入无菌生理盐水，反复洗涤3次。将所有临床标本倒入放有无菌生理盐水的小皿中，并将较大块的肿瘤组织分离成体积<3 mm×3 mm×3 mm的组织碎片，并相应的去除坏死组织以及包膜等的结缔组织。将组织平均分成多份，放入提前混匀的加有75 μl PBS和75 μl Matrigel基质胶的EP管中，放在冰上保存。取NOD-SCID小鼠，按照70 mg/kg的比例，采用3%戊巴比妥钠溶液腹腔麻醉的方式麻醉小鼠，碘伏消毒小鼠背部皮肤，无菌棉球擦拭干净，用高温高压灭菌过的眼科组织剪开背部皮肤，切口约0.4～0.5 cm，使用组织钳钝性剥离皮下组织，用移液器抽出150 μl含有Matrigel的组织块注入皮下组织，用5/0丝线缝合伤口，碘伏消毒。重复上述做法分别接种于背部左上、左下、右上、右下4个位置。术后放回笼中待苏醒。定期观察小鼠伤口的恢复情况、精神、活动、毛发及饮食情况等；观察并记录局部皮下移植瘤体积、成瘤时间、成瘤概率、存活和死亡率。最后处死小鼠取出移植瘤，观察其外观、大小，并分别作常规病理切片HE染色，观察肿瘤组织的形态学特征。

2、肾癌PDX NOD-SCID小鼠原位肾包膜下移植瘤模型的建立：术前准备及麻醉同方法1，于小鼠背部中段剪开一约2 cm切口，钝性分开皮下组织，寻找到脊柱中下段，用眼科剪打开小鼠腹腔，在肝脏靠脊柱内侧寻找肾脏，并完整暴露肾脏，用20 G套管针行肾包膜下穿刺，注意轻柔，误损伤肾实质，用无齿眼科镊从破口处将肾包膜提起，将小块肿瘤组织利用另一把眼科镊轻轻放入包膜下，并向上推至包膜完整部位，需注意小鼠肾脏较脆，易出血损伤，操作需轻柔。肾脏还原原位，用5-0丝线连续缝合腹壁，再用5-0丝线单纯间断缝合皮肤，将伤口表面血渍用碘伏擦净，放入笼中等待苏醒。

结果

1、小鼠荷瘤生长情况及成瘤潜伏期：肾癌标本移植后成瘤潜伏期分别为74天，86天，65天，58天，53天及47天，平均约63.83天，于种植部位可扪及花生粒大小的肿瘤，皮下活动度小，呈红色，质地稍硬呈实体肿块，随后肿瘤体积逐渐增大，小鼠出现程度不等的消瘦、活动度减弱等恶病质情况。

2、小鼠肿瘤生长速度及成瘤率：临床病人肾癌活体标本在经过处理后，在NOD-SCID小鼠皮下行原代移植，每例临床标本移植2只小鼠，共14只。结果，6只小鼠成功移植，分别来自6例不同的临床病人。因此，原代小鼠的移植成瘤率为42.86%。计算相对肿瘤体积(相对肿瘤体积=0.52×长径×短径2)。见表1。

表1 移植瘤生长体积变化(mm3)

3、小鼠移植瘤病理学检查：将所有成瘤小鼠做常规病理切片，HE染色，可观察到除3号小鼠属于瘤样增生外，其他人肾癌移植瘤均可看到肾脏透明细胞癌的特征。见图1～3。

结节内可见边缘处为肿瘤细胞密集似有排列，鲜见核分裂相。瘤样增生可能性大图1 移植肿瘤组织(HE×100)

可见肿瘤局部区域为肿瘤细胞部分有排列，鲜见核分裂相。属于高分化肾透明细胞癌图2 移植肿瘤组织(HE×100)

肿瘤结节内可见边缘处有癌细胞密集，可见核分裂相。癌结节中心可见大片的红染坏死区域，多为崩解碎裂的肿瘤细胞。属于低分化肾透明细胞癌。图3 移植肿瘤组织(HE×100)

讨论

肾癌发病率约为全身恶性肿瘤发病率的2%～3%[11]，男性发病率是女性的2倍，其中80%以上是来源于近曲小管的透明细胞癌，并以每年2%的比例递增[12]。手术切除是临床上最常见的治疗方式。临床上一些局部进展期的肾癌并不少见，约20%～30%病人明确诊断肾癌时已发生淋巴结转移和肾静脉甚至腔静脉癌栓形成，此类病人术后多预后不良，仍有20%～30%病人3年内出现复发及转移，大大降低了病人的生存时间及生存率[13]。传统的放化疗对肾癌治疗不敏感，特别是手术无法切除的晚期肾癌病人，预后较差[14]。

但目前从成功治疗荷瘤动物模型到应用于临床肿瘤治疗的转化过程中，平均成功率不足8%[18]。影响转化率的最主要的原因是：传统的移植瘤模型是把人体肿瘤细胞或鼠源性肿瘤细胞通过体外筛选，并通过细胞传代培养获得稳定的细胞系，然后将其注射到不同程度的免疫缺陷的小鼠皮下组织或者原位从而构建稳定的移植瘤模型。在建构移植瘤模型时，连续传代的肿瘤细胞一般不能适应外界环境，从而丧失了原代肿瘤的异质性，不能反应原始肿瘤的生物学特征[1]。用于单一细胞株上的抗肿瘤疗法难以转化到复杂多变的临床病人中。

随着精准医疗的提出与兴起，对于疾病个性化治疗的模式成为热点，PDX模型具有无可替代的优点，它是把病人术后的活体肿瘤组织移植到不同成度免疫缺陷的小鼠上，得到人源性肿瘤异种移植小鼠。

根据不同肿瘤类型，研究的问题不同，以及预期的结果不同，重要的是选择一个准确PDX模型。当选择合适的免疫缺陷小鼠时需要考虑以下几个因素，包括背景特征(如肿瘤的移植敏感性)，内源性免疫功能(如B或T细胞的存在)，繁殖能力，寿命和遗传特征。

本研究选用6～8周雌/雄NOD-SCID小鼠进行实验，NOD/SCID小鼠是NOD小鼠和prkdcscid基因位点发生纯合子基因突变的SCID小鼠杂交后得到的，其中SCID小鼠T细胞和B细胞丧失基本功能，NOD小鼠的巨噬细胞存在功能缺陷、补体和NK细胞功能降低。因此此种小鼠的肿瘤移植成活率较裸鼠要高。

在肾癌PDX模型的制作方法上，本实验选用了两种肿瘤移植方法：皮下移植及肾包膜下移植。皮下移植的PDX模型已经广泛开展，由于其简单的步骤及肿瘤大小的容易测量，适用于对PDX模型的大量扩增。原位移植模型是表现出更加相似于临床病人肿瘤的生物学行为，尤其是在肿瘤发生、发展、转移等方面，表现出了极大的相似性。但对于不同肿瘤的PDX模型而言，需要有训练有素的外科手术技能相支持。

本研究所构建成功的肾癌PDX模型中，移植瘤与临床病人术后肾癌病理检查有相似的组织学特征，肿瘤细胞部分有排列且肿瘤呈实质状，细胞胞体较大，胞膜清晰，胞浆较宽且透明、胞核大小不一，可见核分裂相。根据病人病理类型不同以及相同病理类型的肿瘤分化程度不一，相对应的PDX模型的移植瘤的病理结果也不同，可见2号病人肿瘤病理类型为肾实质内多形性上皮样细胞肿瘤，PDX模型移植瘤病理为瘤样增生。其余临床病人的病理结果均为肾脏的透明细胞癌，肾癌PDX模型移植瘤的病理结果也为不同分化程度的肾透明细胞癌。因此，说明肾癌PDX移植瘤在其发生发展的过程中，保留了病人原始肿瘤的组织学特性以及生物学特性，同时也保留了不同病人间肿瘤的异质性。