单波长激发-能量色散X射线荧光光谱法检测蔬菜中多种重金属元素

石洪玮 刘晓静 刘贵巧 徐东辉 毛雪飞

(1.河北工程大学，河北 邯郸 056038；2.中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所/农业农村部农产品质量安全监督检验测试中心，北京 100081；3.北京安科慧生科技有限公司，北京 101102；4.中国农业科学院蔬菜花卉研究所/农业农村部蔬菜质量安全控制重点实验室，北京 100081)

蔬菜是世界各地人民日常饮食的重要部分，是人体通过饮食摄取营养的来源之一[1]。蔬菜中含有丰富人体必需的微量矿物质[2]，例如锌在人体中有催化、结构构成、参与调节的功能[3]，且对于核酸和蛋白质的合成有极为重要的作用[4]，还有铜和锰等微量必需元素，它们对人体中多种酶的合成有重要的辅助作用[5]。但是蔬菜中除了含有铜、锌、锰这类微量必需元素外，还有砷、铅、镉等有害重金属元素[6]。例如，砷中毒可能造成的疾病有糖尿病、高血压、神经退行性疾病等[7]；镉中毒会导致人体骨质缺乏，造成骨质软化和骨质疏松症，如19世纪在日本发生的痛痛病事件[8]。目前实验室常用的食品中元素检测的方法有电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)[9-10]、电感耦合等离子体发射光谱法(ICP-OES)[11-12]、石墨炉原子吸收光谱法(GFAAS)[13]、火焰原子吸收光谱法(FAAS)[14]、原子荧光光谱法(AFS)[15]等。上述方法都是准确有效的元素分析方法，也有对应的相关国家标准支持，不过这些方法都需要进行消解才能进行上机测试，消解处理耗时长，且需要强酸、强碱等危险试剂，因此无法实现现场快速检测。此外，ICP-MS和ICP-OES价格昂贵、运维复杂，而普通AFS、AAS无法多元素同测等问题也限制着上述方法的应用。

X射线荧光光谱法是一种无需消解的、无损的元素检测方法，特别是能量色散X射线荧光光谱仪(ED-XRF)可以实现小型化和便携化，常用于材料、矿物、土壤等样品中高原子序数、mg/kg以上含量水平的元素检测[16]。由于食品中重金属元素含量水平较低，常规的ED-XRF较难检出痕量元素或获得较好的分析精密度[17]。本研究使用配备曲面弯晶单色化器的ED-XRF，其中全聚焦双曲面弯晶(DCC)是X射线高分辨率聚焦的关键部件，通过对X射线管产生的初级X射线单色化，可以显著降低X射线谱图的背景、提高信噪比，进而降低XRF的检出限[18]。因此，本研究基于单波长激发-能量色散X射线荧光光谱仪(Monochromatic Wavelength Excitation-Energy Dispersive X-ray Fluorescence Spectrometry，MW-EDXRF)，建立蔬菜中As、Pb、Cd、Cr、Ni、Cu、Zn、Rb、Mn等元素的快速检测方法。

1 材料与方法

1.1 仪器

MW-EDXRF重金属分析仪(PHECDA- PRO，北京安科慧生科技有限公司)配备微焦斑X射线管(钨靶)：满功率12 W，电压10～70 kV，电流0～400 μA，高通量硅漂移探测器(SDD)，Fast FP软件，全聚焦双曲面弯晶(DCC)。全聚焦型双曲面弯晶(Johansson-type DCC)能够对微焦斑X射线管出射的高强特征X射线进行Bragg衍射单色化，并聚焦到直径数十到数百微米的聚焦面，对样品中的元素进行单波长激发。

电感耦合等离子体质谱仪(7900型，安捷伦科技有限公司)，微波消解仪(上海屹尧仪器科技发展有限公司)，纯水机(Milli-Q Acadeemic，美国)，破壁机(935A，中山市惠人电器有限公司)，研磨仪(RM200，德国Retsch公司)，冷冻干燥机(GOLO-SIM，SIM公司)，压片机。

1.2 材料与试剂

硼酸(99.5%，上海吉至生化科技有限公司)，硝酸(69.0%±0.9%，国药集团化学试剂有限公司)，砷、铅、镉、铬、镍、铜、锌、铷、锰元素标准储备液(1 000 mg/kg，国家有色金属及电子材料分析中心)；圆白菜GBW10014(GBS-5)、柑橘叶GBW10020(GBS-11)、蒜粉GBW10022(GBS-13)、紫菜GBW10023(GBS-14)、胡萝卜GBW10047(GBS-25)等生物成分分析标准物质(中国地质科学院地球物理地球化学勘查研究所)。

1.3 样品

本实验使用的蔬菜样品包括菠菜、葱、胡萝卜、豆角、番茄、姜、空心菜、莲藕、芹菜、蒜、香菇等均在北京采购。经微波消解ICP-MS法测定，上述蔬菜中As、Pb、Cd、Ni元素含量较低，XRF法无法检出或稳定检测，因此本研究根据蔬菜中污染物限量标准GB 2762—2017，采用加标、干燥、均质方法[19]制备了加标样品，具体方法为：购买来的蔬菜洗净后，使用无尘布将蔬菜表面水分擦拭干，使用破壁机将蔬菜打浆备用，称取蔬菜浆200 g加入元素混合标准溶液后搅拌均匀，在-40 ℃冷冻到完全结冰后使用冷冻干燥机在-70 ℃负压冷冻干燥24 h，冷冻干燥后使用研磨仪研磨、均质，过0.30 mm筛(60目)后置于棕色玻璃瓶备用。

1.4 实验方法

1.4.1 XRF仪器条件

经优化后，MW-EDXRF重金属分析仪的条件详见表1，其中管电压和管电流的条件由厂家设置。

表1 MW-EDXRF重金属分析仪条件Table 1 Instrumental conditions of MW-EDXRF

1.4.2 电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)检测条件

本部分实验以GB 5009.268—2016《食品安全国家标准 食品中多元素的测定》为依据，按照样品实际情况略作调整。

1.4.2.1 样品前处理

准备3个微波消解管，分别称取(0.2±0.000 1) g样品放置到消解管底部，向消解管中加入3 mL硝酸、2 mL过氧化氢加盖浸泡过夜预消解，使用微波消解仪进行消解(微波消解升温程序见表2)。消解完成并冷却后在加热板上120 ℃赶酸到消解液剩余1 mL左右，使用容量瓶定容到25 mL。

表2 微波消解升温程序Table 2 Microwave digestion heating program

1.4.2.2 仪器条件

安捷伦7900型ICP-MS采用常规碰撞模式进行检测，具体条件如表3所示。

表3 ICP-MS仪器条件与参数设置Table 3 ICP-MS instrumental conditions and parameters

1.4.3 数据分析

本研究中的方差分析部分是使用IBM SPSS Statististics 20进行的单因素方差分析，其中多重比较方法采用最小显著性差异法(Least Significant Difference)和邓肯氏新复极差法(Duncan′s New Multiple Range Test)，在95%置信区间下，P值<0.05则认为存在显著性差异。

2 结果与分析

2.1 X射线扫描及荧光信号采集时间

本研究采用基本参数法对MW-EDXRF重金属分析仪进行定量校准。此时，可以优化的是X射线照射样品的时间，检测时间会影响检测器对X射线激发荧光信号的采集时间、荧光谱图的拟合时间与基本参数法的迭代次数，因此会影响检测的精密度和准确度。本实验利用GBW10022蔬菜基体标准物质，在其他仪器条件确定的情况下进行20～300 s不同照射时间的信号检测(n=3)。图1(a)显示的是XRF辐射时间对检测结果的相对标准偏差(RSD)的影响，其中Cd、As、Pb、Cr、Ni、Cu元素的RSD在20～200 s随检测时间的延长呈显著的下降趋势，当超过200 s时RSD均小于15%，基本可以满足XRF快速筛查的精密度要求；而Rb、Zn、Mn的RSD变化趋势较为平缓，均在10%以下。图1(b)显示的是XRF辐射时间对检测结果回收率的影响，Cd、Cr在20～300 s范围内的回收率随着检测时间增加逐渐降低，当超过200 s时趋近于100%；As、Pb、Ni、Cu等元素的回收率在检测时间大于100 s后趋近于100%；Rb、Zn、Mn等元素的回收率随时间变化不明显。综上可知，XRF辐照时间越长，检测结果精密度(RSD)和准确度(回收率)结果越好。统筹考虑XRF方法精准度和检测效率，最后将检测时间定为200 s，9种元素检测的累积激发时间是600 s。

图1 检测时间对XRF检测结果相对标准偏差(RSD)和回收率的影响(n=3)Figure 1 Effect of XRF radiation time on multi-elemental RSD and recovery in vegetable samples(n=3).

2.2 样品制备条件

本研究采用硼酸包被固体粉末压片的制样方式，需要对压片时固体样品粉末的使用量、压力和压力保持时间进行优化。粉末样品压片后的厚度和密度会影响X射线的辐射效率和荧光密度。当使用XRF进行元素分析时，通常有一个样品临界厚度的概念，可能是初级X射线的穿透深度，也可能是特征X射线的穿透深度。如果达不到临界厚度进行定量分析，会造成仪器分析的精密度下降。在制备粉末压片样品时，压片压力与压力保持时间直接影响压片成品的密度。

2.2.1 压片样品量

分别使用0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g蒜粉末样品，采用硼酸包被制样法，在压力15 MPa、压力保持时间60 s的条件下进行3次重复检测。图2显示是样品量(样品厚度)对XRF检测结果的影响。根据方差分析结果，As、Pb、Cd、Cu、Rb、Fe等元素检测值在称样量0.5～2 g范围内呈逐渐升高趋势，超过2 g后对检测值无显著影响(P>0.05)；Cr、Ni等元素检测值在0.5～1.5 g范围内显著升高，超过1.5 g后对检测值无显著影响(P>0.05)；而Mn元素在超过1 g后对检测值无显著影响(P>0.05)。综合上述结果，最后选择压片样品量为2 g。

图2 压片样品量与检测结果关系图(n=3)Figure 2 The relationship between sample size and test results(n=3).

2.2.2 压片压力

采用硼酸包被的方法，在2 g样品量，60 s压力保持时间的条件下分别用10、15、20、25、30、35 MPa的压力下制备蒜粉样品压片，并对检测结果进行单因素方差分析(图3)。结果显示，压片10～35 MPa对各元素测定值均无显著性影响(P>0.05)。但是，10 MPa压片后的样品易松散，不利于保存，因此最后选择压片压力15 MPa。

图3 压片压力与XRF检测结果(n=3)Figure 3 Tablet pressure and XRF detection results(n=3).

2.2.3 压力保持时间

采用硼酸包被方法，在2 g样品量，15 MPa的条件下分别用30、60、120、150、180 s的压力保持时间制备蒜粉压片样品，并对检测结果进行单因素方差分析(图4)。结果显示，压片30～180 s对各元素测定值均无显著性影响(P>0.05)。但是，30 s压片后的样品易松散，不利于保存，因此最后选择2 g样品量在15 MPa条件下压片60 s处理。

图4 压力保持时间与检测结果关系图(n=3)Figure 4 Relationship between tablet pressing time and test results(n=3).

2.3 方法验证

2.3.1 方法检出限与定量限

为确定本实验的方法检出限与定量限，使用空白纤维素粉末样品进行11次重复检测，取测试结果3倍的标准偏差(SD)作为方法检出限，10倍作为定量限[21]。从表4可以看出，As、Pb、Cd、Cr、Ni、Cu、Zn、Rb、Mn等元素的检出限(LOD)为0.07～0.32 mg/kg，其中重点关注的有害重金属As、Pb、Cd的LOD为0.07 mg/kg，能够满足食品安全国家标准的污染物限量要求。

表4 MW-EDXRF检出限与定量限Table 4 Limits of detection and quantification of MW-EDXRF(n=11) /(mg·kg-1)

2.3.2 精密度评价

使用2 g蒜粉在压片压力15 MPa，压力保持时间60 s的条件下制备样品压片，进行11次重复检测，结果见表5。各元素的RSD值在1.0%～10.0%，表明MW-EDXRF测定蔬菜中9种元素的方法有良好的检测精密度。

表5 MW-EDXRF的检测精密度Table 5 Precision of MW-EDXRF detection(n=11)

2.3.3 准确度评价

为验证本实验检测方法的准确度，使用MW-EDXRF对5种蔬菜基质的有证标准物质(Certified Reference Materials，CRMs，包括GBW10014、GBW10020、GBW10022、GBW10023、GBW10047)样品进行测定，并根据CRMs的标定值计算回收率，结果见表6。可以看出，除有个别检测结果在MW-EDXRF的检出限附近，显示未检出，其他测定值的回收率均在80.0%～119%，并且也都在标准物质的不确定度范围内。

表6 基体标准物质的MW-EDXRF测定结果Table 6 Elemental presence in vegetable CRM samples by the MW-EDXRF method(n=3)

此外利用本方法测定了11种蔬菜样品(菠菜、葱、胡萝卜、豆角、番茄、姜、空心菜、莲藕、芹菜、蒜、香菇等)中As、Pb、Cd、Cr、Ni、Cu、Zn、Rb、Mn等元素的含量，与标准方法ICP-MS检测的结果进行对比，通过线性回归系数(R2)来分析两种方法测定结果的符合程度，结果见图5。可以看出，除Cu的R2为0.983 8，其余8种元素的R2均大于0.99，XRF与ICP-MS标准方法的检测结果具有较好的一致性，表明新建立的蔬菜中多元素MW-EDXRF法具有良好的检测准确度。

图5 XRF与ICP-MS检测结果回归曲线Figure 5 Regression curves of XRF and ICP-MS detection results.

3 结论

本研究使用单波长激发能量色散X射线荧光光谱仪建立了蔬菜样品固体直接分析的重金属As、Pb、Cd、Cr、Ni、Cu、Zn、Rb、Mn检测方法。当仪器进样量为2 g，样品在15 MPa压片60 s后，菠菜、葱、胡萝卜、豆角、番茄、姜、空心菜、莲藕、芹菜、蒜、香菇等蔬菜样品中多元素的LOD为0.07 ～0.32 mg/kg，其中重点关注的有害重金属As、Pb、Cd的LOD为0.07 mg/kg，能够满足食品安全国家标准的污染物限量要求。该方法对蔬菜样品多次测定的RSD在3.0%～10.0%，回收率在80.0%～119%，具有良好的检测精密度和准确性。同时，该仪器仅有不到10 kg，不需要样品消解处理，检测时间在10 min左右，非常适合蔬菜多种重金属的现场快速筛查。