液相色谱-质谱/质谱串联法测定番茄酱中六种红曲色素

◎ 王 震

（诺安实力可商品检验（上海）有限公司，上海 201112）

红曲色素是以大米或大豆为主要原料，由曲霉属中的红曲霉、变红红曲霉、紫红红曲霉和马米加红曲霉等菌种发酵提取后得到的一种天然色素，为深紫红色粉末，其中已知成分包含红、黄、橙3种色系10种化合物。作为一种天然的食品色素添加剂，红曲色素在食品中少量的添加对人体危害较小，性甘、温、无毒，并且具有利于消化、降脂、活血等功效，除了可作为着色剂使用，还具有一定的抗菌作用。有研究表明其对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、灰色链霉菌以及大肠杆菌具有一定的抑制作用。红曲色素中含有多种化合物，在水及醇等有机试剂中都具有溶解性，且化学性质稳定。本次试验针对其中6种化合物，包括潘红胺、红曲红胺、红曲素、红斑素、红曲黄素以及红曲红玉素进行研究，结构式见图1。

图1 6种红曲色素结构式图

目前国内针对食品中红曲色素的测定方法不多，且方法中可参考测定的目标化合物较少，红曲色素的添加量在食品添加剂使用标准中有限量要求[1-3]。目前，国内红曲色素检测方法有液相色谱法和液相色谱-质谱法两种。液相色谱法是目前使用较多的方法，但其抗基质干扰能力差，前处理操作步骤烦琐，耗时费力，化合物的灵敏度和准确性低于质谱法[4-7]。本文通过提取液直接提取，节约了样品前处理时间，提高检测效率。利用反相C18色谱柱分离番茄酱中的潘红胺、红曲红胺、红曲素、红斑素、红曲黄素以及红曲玉红素6种成分，通过优化液相流动相的梯度洗脱程序以去除基质中的杂质干扰、改善色谱峰峰型，并用质谱检测器在正离子模式下多反应监测测定其含量，为食品安全的控制提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验原理

测试原理参考《出口食品中红曲色素的测定》 （SN/T 3843—2014）[1]，番茄酱中的红曲色素用乙腈水溶液分别提取其中的水溶性色素及脂溶性色素，离心过滤后待上机。用标准加入法，在空白的样品基质中加入不同浓度的标准品，并用相同的提取方法提取溶液用以制作标准曲线，用LC- MS/MS 测定确认。使用标准品线性的最低点、中间点、最高点浓度加标3 平行并重复测试两天，同时测定样品空白，以验证试验的重复性、重现性与定量限。

1.2 试剂与标准品

潘红胺（Rubropunctamine）标准品：有证标准品，分子式为C21H23NO4，纯度≥95%，CAS 514-66-9，购自Carbosynth；红曲红胺（N-Fmoc-8-aminooctanoic acid）标准品：有证标准品，分子式为C23H27NO4，纯度≥99%，CAS 126631-93-4，购自上海安普实验科技；红曲素（Monascin）标准品：有证标准品，分子式为C21H26O5，纯度≥98%，CAS 21516-68-7，购自成都乐美天医药科技；红斑素（Rubropunctatin）标准品：有证标准品，分子式为C21H22O5，纯度≥ 95%，CAS 514-67-0，购自深圳东方蓝泰科技；红曲黄素（Ankaflavin）标准品：有证标准品，分子式为C23H30O5，纯 度≥98%，CAS 50980-32-0，购 自Carbosynth；红曲玉红素（Monascorubrin）标准品：有证标准品，分子式为C23H26O5，纯度≥94%，CAS 13283-90-4，购自深圳东方蓝泰科技；乙腈、甲酸，色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司；水，二级水（GB/T 6682—2008）。

1.3 仪器与设备

本试验用到的主要仪器与设备见表1。

表1 仪器与设备表

1.4 试验方法

1.4.1 样品提取

称量10.0 g 番茄酱样品于50 mL 离心管中。加入40 mL 乙腈水（v∶v=9 ∶1）提取液，漩涡混匀后，置于台式振荡器中振荡1 h。置于高速离心机中于 4 000 r·min-1离心10 min 后，将上清液转移至100 mL容量瓶，再次加入适量乙腈水（v∶v=9 ∶1）提取液重复提取样品两次，合并提取液至100 mL 容量瓶中，用乙腈水定容至刻度。取上清液过膜后待液相色谱串联质谱仪上机分析。

1.4.2 红曲素混合标准溶液制备

取5 份空白样品，分别加入10 mg·L-1标准品混合 溶 液0.300 mL、0.200 mL、0.100 mL、0.050 mL、 0.025 mL 和0.010 mL 按样品前处理操作进行提取，过膜后得到0.001 ～0.030 mg·L-1的混合标准工作溶液。

1.4.3 仪器条件

液相条件：流动相梯度程序见表2；进样量：10 μL；柱温：40 ℃；流速：0.4 mL·min-1；离子源模式：ESI+，多反应监测，MRM；离子源温度：325 ℃；鞘气温度：400 ℃；鞘气流速：10 L·min-1；离子源喷雾电 源：5 500 V；色谱柱：ChormCore C18（2.1 mm×150 mm，3 μm）。纳谱分析，质谱条件见表3。

表2 梯度参考条件表

表3 6种红曲色素质谱条件表

2 结果与分析

2.1 仪器条件的优化

用0.1%甲酸乙腈和0.1%甲酸水作为液相系统的流动相，用梯度洗脱方式在反相C18色谱柱中分离基质干扰和不同的目标物，初始流动相的比例以高水相为主（80%水相），后用梯度洗脱系统提高有机相比例使目标物在合适的时间出峰，结果发现色谱峰的峰型窄、没有分叉和拖尾，见图2。目标物全部出峰后用更高的有机相比例（90%有机相），可以有效去除基质中的杂质，防止干扰下一针的进样图谱。

图2 6种红曲色素标准物质色谱图

对于质谱检测器条件而言，由于本次试验的6种目标化合物在离子源中的加电模式均为[M+H]+形式，在乙腈和水中加入微量的甲酸可以有效提高目标化合物的离子化效率和灵敏度。同时为了提高各个化合物的响应，在MS 信号采集时可以设定保留时间分段采集信号，每个化合物的采集信号可设定为（RT±0.5）min，各个化合物的最低点浓度的色谱峰均超过10 倍信噪比。在全部化合物出峰后将MS 进样状态设定成“waste”可以有效减少离子源和四极杆的污染。

2.2 标准曲线

根据色谱图（见图3），读取色谱峰面积值，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。在0.001 0 ～0.030 0 mg·L-1浓度范围内，6 个化合物的校准曲线的线性相关系数均满足大于0.995 的要求[8]，说明线性在该定量范围符合标准要求，具体见图3。

图3 6种红曲色素基质匹配标准曲线图

2.3 加标回收试验结果

取番茄酱空白基质样品，准确称取10 份，一份不加入标准品作为基质空白，其他9 份分别在每份样品中加入标准曲线范围低、中、高浓度的标准溶液各3份，按照1.4.1 的试验步骤测定样品后，在液相色谱仪质谱检测器上读取峰面积，计算含量结果，线性同样品前处理上机测定，通过两天测定空白基质，样品图谱中6种红曲色素没有阳性峰，基质样品中也没有数值 （见表4），故基质对加标没有干扰。通过3 个浓度点的基质加标并测试两天，观察两天测试结果的回收率，对方法的重复性与重现性进行验证，数据见表4。不同浓度的回收率的平均值均满足80%～110%的要求，说明准确度符合标准要求[8]。基质每个加标水平的回收率的相对标准偏差满足小于15%的要求，精密度符合标准要求[8]。

表4 基质加标回收结果表

2.4 检出限

基质最低加标水平0.010 mg·kg-1能同时满足准确度和精密度的要求，满足测试标准的要求，故将最低加标值0.010 mg·kg-1作为此次验证的检出限，满足食品中添加剂使用标准限量标准的最低含量要求[9]。

3 结论

从本次试验结果可以看出采用液相色谱-质谱/质谱串联法可以准确测定番茄酱中六种红曲色素的含量，方法准确性和精密度均符合标准要求，检出限也能符合国内添加剂使用量的要求。本文通过使用LC-MS/MS 方法解决了采用常规液相色谱检测中前处理操作步骤烦琐、抗干扰能力弱、灵敏度和准确性差的问题，并在国内检测标准的基础上新增了几种目标化合物，不仅提高了检测效率，还为国内对红曲色素的研究提供参考。