原花青素和原儿茶酸的协同抗氧化作用

◎ 程菲儿，刘惠卿，张文静

（山西农业大学 食品科学与工程学院，山西 太原 030001）

自由基是机体在进行生命活动时产生包含一个非成对电子的原子团[1]。机体健康时产生清除自由基的酶类如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽还原酶等保持体内平衡[2]。年龄增长及外部条件作用（如烟酒、辐射、紫外线和农药等）会使体内自由基过量，引起细胞结构破坏、机体老化，诱发心血管疾病、动脉粥样硬化等疾病[1]。抗氧化剂的摄入可减少机体内过多自由基造成的危害，其来源可分为天然和人工合成两类。天然抗氧化剂从果蔬及动物体内获得，如多酚、维生素等，它们具有抗氧化、消炎、防衰老、抑菌和降血糖血脂等功效，相比人工合成毒性低、效果好[3]。

原花青素（Proantho Cyanidins，PC）和原儿茶酸（Protocatechuic Acid，PCA）是两种抗氧化性较强的天然抗氧化剂，对自由基的猝灭作用较强。PC 是一类多酚化合物，在葡萄籽、蓝莓等植物中大量存在，其含有的多电子酚羟基结构，具有较高的抗氧化活性[4]。低聚PC 能减少线粒体毁坏阻断细胞衰老进程，增加机体抗氧化性能；在衰老小鼠体内，PC 能显著增强抗氧化酶类的活性延缓小鼠的衰老速度[5-6]。PCA 是存在于果蔬中的酚酸类物质，能与细胞中活性氧自由基（Reactive Oxygen Species，ROS）结合使其猝灭，降低ROS 含量，减缓细胞损伤和凋亡[7]；还具有抗炎的作用，降低肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor，TNF-α）和白细胞介素-1β（interleukin-1β）等促癌因子的生成，减缓炎症反应[8]。

研究表明，复配后的天然抗氧化剂之间能相互促进，产生显著的协同抗氧化效果[3]。通过对天然抗氧化剂的种类、浓度等进行优化，探究协同抗氧化能力，有助于降低生产成本，避免抗氧化剂过多使用所带来的安全问题，对于开发高效、低毒、低成本的抗氧化剂具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

原花青素、原儿茶酸，北京索莱宝科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH 自由基），美国Sigma 公司；三氨基甲烷-盐酸缓冲液（Tris-HCl）、邻苯三酚和无水乙醇均为分析纯。

1.2 仪器与设备

Spectramax i3x 多功能酶标仪，美谷分子仪器上海有限分公司；SP-1910UVPC 型紫外可见分光光度仪，上海光谱仪器有限公司；HHS 型电热恒温水浴锅，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；BS210S型电子天平，德国赛多利斯公司。

1.3 实验方法

1.3.1 溶液的配制和复配

将PC 溶液制备成10 mg·L-1、20 mg·L-1、30 mg·L-1、40 mg·L-1和50 mg·L-1的梯度质量浓度，将PCA 配成2 mg·L-1、4 mg·L-1、5 mg·L-1、8 mg·L-1和10 mg·L-1的梯度质量浓度。将PC 与PCA 分别按质量比1 ∶3、1 ∶1 和3 ∶1 进行复配，用于后续清除率测定。

1.3.2 自由基清除率的测定

DPPH 在517 nm 处测定吸光值。DPPH 清除率计算公式为

式中：A1为加入样液后DPPH 溶液的吸光值；A2为加入样液后无水乙醇的吸光值；A0为加入蒸馏水后DPPH 溶液的吸光值。

超氧阴离子320 nm 处测定吸光度，超氧阴离子清除率计算公式为

式中：A1为样液、邻苯三酚和Tris-HCl 混合溶液的吸光值；A2为样液、蒸馏水和Tris-HCl 混合溶液的吸光值；A0为以蒸馏水、邻苯三酚和Tris-HCl 混合溶液的吸光值。

1.3.3 Isobologram 分析法

实验计算出PC 和PCA 各自的半数清除浓度及95%置信限，并计算出复配物的半数清除浓度。绘制PC 和PCA 的IC50值和95%置信度，将样品复合后得到的IC50值绘入坐标内。

1.3.4 统计学方法分析两种原料的相互作用

实验通过计算相互作用指数γ评价复配能力。复配物的理论IC50add值计算公式为

式中：Q为A、B 两种抗氧化剂单独作用时的效价比，即Q=IC50A/IC50B；K1、K2分别为抗氧化剂A、B 在复配体系中所占的比例，K2=1-K1。

通过上述实验能够算出复合物实际上消灭50%自由基时所需的浓度，即IC50mix值。得到PC 和PCA 复配后理论上猝灭50%自由基所需的浓度，即IC50add值[9]。将二者进行比较，若IC50mix＜IC50add，即可证明两种样品复配之后具有协同抗氧化活性。

复配物之间协同作用的强弱用γ值来表示，计算公式为

式中：IC50Amix、IC50Bmix分别为复配体系中A、B两种抗氧化剂各自的IC50值；IC50A、IC50B分别为A、B 两种抗氧化剂单独作用时的IC50值。若γ=1，表示相互作用为相加；若γ＜1，表示二者之间存在协同，γ值越低药物之间的协同作用越强；若γ＞1，表示相互作用为拮抗作用。

2 结果与分析

2.1 PC 和PCA 清除自由基的能力

由图1（a）可知，PCA 的浓度达到10 mg·L-1时，清除率为28.98%，PC 浓度为50 mg·L-1时，清除率为41.59%。PC 与PCA 的半数清除浓度分别为60.32 mg·L-1、 17.53 mg·L-1。猝灭超氧阴离子自由基的强弱顺序为PCA ＞PC。由图1（b）可知，PC、PCA 消灭自由基的比例与浓度成正比，最后达到稳定。当PCA 的浓度是10 mg·L-1时，它能消灭78.44%的DPPH，而此时PC 的清除率仅为39.20%。当PC 的浓度为50 mg·L-1时，其清除率达到85.62%。PC 和PCA 的IC50值分别为13.66 mg·L-1和5.80 mg·L-1。清除DPPH 自由基的强弱顺序为PCA ＞PC。

图1 PC 和PCA 对自由基的清除率图

2.2 Isobologram 法评价PC 和PCA 的相互作用

2.2.1 PC 和PCA 复配后对自由基清除率的测定

PC 和PCA 复配后对于自由基的清除率如表1 所示。二者复配的实际的IC50mix值见表2。

表1 不同比例PC 和PCA 对DPPH、超氧阴离子自由基的清除率表

表2 PC 和PCA 复配后清除DPPH、超氧阴离子自由基的IC50mix 值表

2.2.2 复配后的Isobologram 分析图

根据表1、表2 绘制复配物对DPPH 自由基、超氧阴离子自由基清除率的等辐射分析，如图2 所示，PC 和PCA 复配后作用点均位于相加线及95%置信区的下方，这表明二者之间为协同作用。

图2 PC 和PCA 复配后清除自由基的Isobologram 分析图

2.3 统计学分析

计算复配组对DPPH 自由基、超氧阴离子自由基理论上的IC50add值，将IC50mix值与IC50add值进行比较，结果见表3。

表3 PC 和PCA 复配后的统计学分析表

由表3 可知，对于自由基指标下的每一个复配比的理论IC50mix值都比实验IC50add值小，各组合的γ值也均小于1。即证明PC与PCA按不同比例重新组合后，复合物清除自由基的效果比样品单独作用时强，具有协同效果。结果表明，PC 和PCA 复配对超氧阴离子的清除能力更强，其相互作用指数可达0.28。在清除DPPH 自由基时，PC ∶PCA 复合后的抗氧化性次序为3 ∶1 ＞1 ∶1 ＞1 ∶3；在清除超氧阴离子自由基时，复配组的抗氧化性的次序为1 ∶1 ＞3 ∶1 ＞1 ∶3。

3 讨论

PC 和PCA 都具有较强的抗氧化效果。本研究将PC 和PCA 复配，利用等辐射分析法并辅助相互作用指数对结果进行评价，从而较为全面地分析了复配的协同抗氧化作用。等辐射分析法又称Isobologram 分析法，被称为评价药物间相互作用的“黄金标准”。通过绘制等辐射分析图，从而说明样品间的相互作用，可以简单、有效地评估样品在复配后的联合应用效果。通过统计学分析得到的γ值对得到复合抗氧化剂产生最佳抗氧化效果的复配比提供一定的参考依据。通过Isobologram 分析法得到PC 和PCA 复配后的抗氧化效果优于两种单一成分，在对不同的自由基产生作用时，复配比不同，结果也不同。周甜甜等[10]在关于落叶松树皮与蓝莓花青素的协同抗氧化研究中，得到的γ值集中在0.5 ～0.9，协同作用最强时，γ值为0.54。而PC 和PCA 复配后清除自由基时，其γ值甚至可以达到0.28，充分证明了PC 和PCA 协同抗氧化性较强。龚艳振等[11]在关于天然抗氧化剂复配研究进展中提到，抗氧化剂复配后在一起发挥协同作用的机理主要有修复再生或新生、偶联氧化、吸收氧气以及抗氧化剂之间的相互作用等。段方娥等[12]对在辣椒素与槲皮素、芦丁协同抗氧化作用的研究中提到辣椒素与槲皮素、芦丁复合后的协同抗氧化性强于单一成分，其可能机制是抗氧化性相对较弱的辣椒素能修复再生抗氧化性强的槲皮素和芦丁，反应体系中出现了完整的氧化还原回路，使得复配物的协同抗氧化性增强。PC 和PCA 复配后对于自由基清除率增强，也可能是因为氧化能力较弱的PC 对抗氧化能力较强的PCA 产生了一定的修复作用，使得复配之后的复合相较于两种单一作用有较好的协同抗氧化效果。多酚类物质与其他抗氧化剂复配后发生协同作用的机理可以解释为基于氧化还原电位差的偶联氧化。而PCA 也是一种抗氧化性较强的多酚类物质，有理由推断其与PC 发生协同抗氧化的机理是因为发生了偶联氮化。

4 结论

PC 和PCA 在对于自由基的清除中均能发挥出很强的作用，但是由于反应体系不同，因此抗氧化效果也会存在一定的差异。PC 和PCA 在复配后的抗氧化活性强于单一组分，并且二者复配比的差异也对复合物的协同抗氧化效果有所影响。因此，在后续的研究中需要进一步探讨复合抗氧化剂的最佳配比，使其发挥出最大的协同抗氧化性，从而能更好地指导生产实践，为其他酚类物质复合抗氧化剂的开发提供一定的参考价值。