左乙拉西坦pH敏感鼻用凝胶剂在大鼠脑组织内生物利用度的研究

李爽，黄晶，丛志新，谷福根（1.内蒙古医科大学附属医院，呼和浩特 010050；2.内蒙古医科大学药学院，呼和浩特 010110）

左乙拉西坦（levetiracetam）是一种新型广谱抗癫痫药物，临床主要用于难治性癫痫的添加治疗[1]。与其他抗癫痫药物相比，左乙拉西坦具有选择性高、不良反应少、耐受性好等特点[2-3]。左乙拉西坦上市剂型有片剂、口服溶液、注射液等。口服制剂吸收起效较慢，注射剂使用不便，且上述两种给药途径均因血脑屏障的存在以及该药物极性大等原因，导致进入脑组织内药量少，其临床疗效受到一定程度影响[4]。鼻腔给药具有吸收快、生物利用度高、给药方便以及脑靶向性递药等特点，在中枢神经系统疾病药物治疗中已显示良好的临床应用前景[5-6]。因此，本文在前期完成左乙拉西坦的pH 敏感鼻用凝胶剂的处方优化[7]及其在动物体内生物利用度研究的基础上，进一步考察该药物鼻用新制剂在大鼠脑组织内的药动学并初步评价其脑靶向性，旨在为今后研究开发左乙拉西坦鼻腔给药新制剂提供重要理论依据。

1 材料

1.1 仪器

LC-20AT 高效液相色谱仪（日本岛津公司）；VORTEX-5 旋涡混合器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；KQ5200E 超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；H1750R 高速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；Arioso UP 900超纯水器（韩国Human 公司）。

1.2 试药

左乙拉西坦对照品（湖北威德利化学科技有限公司，纯度：99.0%，批号：WDL180212）；左乙拉西坦pH 敏感鼻用凝胶（自制，批号：20200709，浓度为1.0%）；甲硝唑对照品（内标，北京索莱宝科技有限公司，纯度：98%，编号：SM8460）；生理盐水（石家庄四药有限公司，批号：1808073402）；乙酸乙酯（分析纯，天津新技术产业园区科茂化学试剂有限公司）；乙腈、甲醇均为色谱纯，水均为超纯水，其他试剂均为分析纯。

1.3 实验动物

雄性SD 大鼠，体质量200 ～250 g [内蒙古大学实验动物中心，生产许可证号：SCXK（蒙）2016-0001]。

2 方法及结果

2.1 色谱条件[8]

色谱柱：InertSustainC18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；保护柱：Wonda Sil C18（10 mm×4 mm，5µm）；流动相：乙腈-水（11∶89，V/V）；流速：1.0 mL·min－1；柱温：室温；检测波长：205 nm，进样量：20 µL。

2.2 脑样品处理[9]

按质量与体积之比1∶3 加入生理盐水，在冰水浴条件下，将大鼠全脑进行匀浆，匀浆液以11 000 r·min－1离心5 min，取上清液100 μL 置于EP 管中，分别加入甲醇40 µL，7 μg·mL－1甲硝唑水溶液20 µL，旋涡混合30 s，再加入乙酸乙酯1000 µL，旋涡混合3 min，以11 000 r·min－1离心3 min，取上清液于另一EP 管中，45 ℃水浴中氮气吹干，残渣用100 μL 流动相复溶，再以11 000 r·min－1离心3 min，取上清液进样。

2.3 专属性考察

分别取空白脑匀浆，空白脑匀浆加左乙拉西坦对照品，左乙拉西坦经鼻腔与灌胃给药30 min 后脑匀浆样品各100 μL。按“2.2”项下方法处理后进样测定，记录色谱图，结果见图1。可见，在该色谱条件下，左乙拉西坦保留时间为7.2 min，内标保留时间为8.6 min，两者分离良好，且无内源性物质干扰，表明该方法专属性良好。

图1 左乙拉西坦在大鼠脑匀浆中HPLC 图Fig 1 HPLC chromatograms of levetiracetam in the rat cerebral tissues

2.4 标准曲线的制备

精密称取左乙拉西坦对照品约5.0 mg，加水制得100 μg·mL－1的左乙拉西坦储备液。再用水稀释，分别配制为1.2、2.4、4.8、6.0、12.0、24.0、36.0 μg·mL－1的系列对照品溶液。取大鼠空白脑匀浆100 μL，分别加入上述对照品溶液20 μL，制得质量浓度为0.2、0.4、0.8、1.0、2.0、4.0、6.0 μg·mL－1的系列脑匀浆标准样品，按“2.2”项下方法处理后进样测定。以左乙拉西坦的质量浓度（X）为横坐标，药物与内标的峰面积比（Y）为纵坐标，作线性回归，求得回归方程为：Y＝0.2868X＋0.021，r＝0.9995，表明左乙拉西坦在0.2 ～6.0 μg·mL－1内与峰面积比呈良好的线性关系。

2.5 精密度考察

取空白脑匀浆100 μL，同法配制0.4、1.0、4.0 μg·mL－1的左乙拉西坦脑匀浆质控样品，各5 份，按“2.2”项下方法处理后进样测定，日内重复测定5 次，连续测定5 d，结果低、中、高质量浓度的日内RSD分别为2.0%、1.0%、1.7%，日间RSD分别为1.1%、2.1%、1.4%，表明该方法精密度良好。

2.6 回收率的考察

配制质量浓度分别为0.4、1.0、4.0 μg·mL－1的左乙拉西坦脑匀浆质控样品，各5 份，按“2.2”项下方法处理后进样测定，计算方法的相对回收率和提取回收率，结果低、中、高质量浓度的相对回收率分别为（91.96±0.02）%、（96.44±0.03）%、（106.54±0.01）%，RSD分别为2.2%、3.4%、0.89%，提取回收率分别为（97.12±0.02）%、（94.37±0.03）%、（89.38±0.02）%，RSD分别为1.9%、3.1%、2.7%，满足生物样品分析要求。

2.7 检测限和定量限

将药物浓度逐步递减，制备系列不同浓度左乙拉西坦脑匀浆样品，按“2.2”项下方法处理后进样测定，记录色谱图，以信噪比S/N＝3 作为检测限，S/N＝10 作为定量限。结果该方法检测限为0.2 μg·mL－1，定量限为0.8 μg·mL－1。

2.8 样品稳定性考察

配制质量浓度分别为0.4、1.0、4.0 μg·mL－1的左乙拉西坦脑匀浆样品，分别在室温下放置24 h，按“2.2”项下方法处理后在进样室放置24 h，冻-融循环3 次，－20℃冷冻放置5 d，考察样品的稳定性。结果脑匀浆样品在上述不同条件下放置，各浓度样品的RSD均＜5%，表明该药物脑匀浆样品具有较好的稳定性。

2.9 大鼠脑组织中药动学研究

取SD 大鼠56 只，随机均分为鼻腔给药组与灌胃给药组，灌胃给药组实验前禁食12 h，自由饮水。灌胃给药组给予0.1%左乙拉西坦溶液（临用前蒸馏水配制），剂量为10.0 mg·kg－1。鼻腔给药组给药方法见文献[5]，剂量为1.0 mg·kg－1。两组均分别于给药5、15、30 min，1.0、2.0、4.0、6.0 h 后将动物断头处死，分离全脑组织，依照“2.2”项下方法处理后，进样测定。

根据动物脑组织质量和匀浆时所加生理盐水体积，将大鼠脑匀浆中药物质量浓度单位μg·mL－1换算成μg·g－1后，计算均值并绘制脑组织药物浓度-时间曲线图。根据实测数据，直接读取左乙拉西坦在脑组织中的药动学参数tmax与Cmax值，AUC0～t采用梯形面积法计算，AUCt～∞采用公式：AUCt～∞＝Ct/ke，进行计算，式中，Ct为最后一个采样时间点所测脑组织中药物浓度，ke为消除速率常数。结果见图2，求得左乙拉西坦在脑组织中的主要药动学参数见表1。可见，左乙拉西坦的pH 敏感鼻用凝胶经鼻腔给药后，药物进入大鼠脑组织中的速度很快，其tmax约为30 min，远小于灌胃途径的1.25 h。参照血中药物相对生物利用度（Fr）计算方法[10]，以左乙拉西坦溶液灌胃给药为参比，求得该药物pH敏感鼻用凝胶剂在脑组织中的Fr为476.83%。

图2 左乙拉西坦鼻腔和灌胃给药后在大鼠脑组织中平均药物浓度-时间曲线（n ＝4）Fig 2 Mean drug concentration-time curves in brain tissues after the nasal and intragastric administration of levetiracetam to rats（n ＝4）

表1 左乙拉西坦鼻用凝胶剂及其溶液在大鼠脑组织中的主要药动学参数(x±s，n ＝4)Tab 1 Main pharmacokinetic parameters in the brain tissues after the administration of levetiracetam nasal gel and solution in rats (x ±s，n＝4)

3 讨论

3.1 色谱条件的选择

本文首次尝试建立一种特异性强、灵敏度较高的动物脑组织中药物浓度的HPLC 测定方法。在色谱条件摸索中，作者曾使用柱长仅为150 mm 的Wondasil C18反相柱，结果发现，药物及内标峰形较差，并有内源性物质干扰，后更换柱长为250 mm 的InertSustain C18反相柱，结果药物及内标峰形明显改善，也消除了内源性物质干扰，究其原因，可能与色谱柱过短导致各成分分离时间不足以及不同厂家柱内填料存在差异有关。此外，根据文献报道[11]，曾使用磷酸盐缓冲液（pH 4.0）-乙腈（93∶7）作为流动相，发现药物峰形较差，并有内源性物质干扰，后换乙腈-水（11∶89）为流动相，结果药物及内标峰形良好，保留时间适宜，也无内源性物质干扰测定。此外，在内标筛选中，作者曾选择盐酸小檗碱、氢溴酸西酞普兰、盐酸多奈哌齐以及甲硝唑作为内标，结果发现前3 种候选内标物与药物峰几乎重叠，经多次调整流动相组成比例，两者仍无法达到基线分离，而当用甲硝唑作为内标时，可实现与药物峰的完全分离，且其峰形良好，保留时间适宜，这与文献报道一致[9]。因此，本文最后选择甲硝唑作为内标。在大鼠脑匀浆的前处理过程中，曾采用甲基叔丁基醚、乙醚、二氯甲烷、甲醇、乙腈等作为萃取剂或蛋白沉淀剂，结果均不理想，后参考文献[11]换用乙酸乙酯为萃取剂，提取回收率较理想。

3.2 给药剂量的选择

左乙拉西坦临床单次口服剂量一般为500 mg，按体表面积换算为大鼠灌胃给药剂量为45 mg·kg－1，文献[4]中左乙拉西坦经小鼠鼻腔给药剂量为25 mg·kg－1，换算为大鼠鼻腔给药剂量为18 mg·kg－1，本研究中灌胃给药剂量10 mg·kg－1，仅约为理论折算剂量的1/5，鼻腔给药剂量为1.0 mg·kg－1，为文献报道剂量的1/20。在预实验中发现，当鼻腔给药与灌胃给药剂量相同时，脑组织样品中左乙拉西坦的浓度远超标准曲线浓度的上限，测定前需要对样品进行稀释处理，为了使两种给药途径脑样品中药物浓度尽量采用同一标准曲线来定量，研究中将鼻腔给药剂量减少至灌胃剂量的1/10。

3.3 脑靶向性评价

左乙拉西坦只有进入脑组织内才能发挥治疗癫痫的作用，口服与注射途径给药，药物均必须由血液循环透过血脑屏障才能入脑。亲脂性的药物，更易透过血脑屏障进入脑内，而亲水性药物不易透过血脑屏障[12]。由于左乙拉西坦属于亲水性药物，极性大，导致其不易透过血脑屏障，故上述途径给药后，入脑速度慢且药量少。本研究发现，左乙拉西坦的pH 敏感鼻用凝胶经鼻腔给药后，药物在大鼠脑组织中的tmax显著小于灌胃给药，表明其入脑速度快于灌胃给药。采用脑组织中药物生物利用度指标来评价鼻腔给药制剂的脑靶向性早有报道[13]，本文中左乙拉西坦鼻用凝胶在脑组织中的Fr高达476.83%，表明该制剂具有脑靶向性[14]，此结果也与文献报道[4]一致。鉴于左乙拉西坦在体内的药动学具有呈线性特性[15-16]，且本研究鼻用给药剂量仅为灌胃给药1/10 时，但鼻腔给药后测得药物在脑中的Cmax、AUC0～t以及AUC0～∞约为灌胃给药途径的1/2，因此，预测给药剂量相同时，pH 敏感鼻用凝胶经鼻腔给药脑组织中药物的Cmax、AUC0～t以及AUC0～∞值将远大于灌胃给药。表明左乙拉西坦鼻用制剂具有明显脑靶向性，其主要机制可能为：一方面该制剂给药后，在鼻腔可快速形成不可流动的半固体凝胶形式，在鼻腔滞留时间明显延长，药物在体内生物利用度改善，血脑屏障两侧药物浓度梯度增大，导致药物由血循环透过血脑屏障入脑药量增加[17-18]；另一方面，鼻腔给药后，部分药物可绕开血脑屏障，在鼻腔嗅区沿嗅神经-嗅球通路直接入脑，即脑靶向递送药物[19]。综上所述，本文中左乙拉西坦pH 敏感鼻用凝胶剂具有给药方便、入脑速度快、脑靶向性强等特点，预期有良好的临床应用前景。