苍耳子多糖的理化性质与生物学活性研究

施 洋, 熊善强, 胡晓波, 张竞成, 刘 咏, 王军辉,

(1.合肥工业大学 农产品生物化工教育部工程研究中心,安徽 合肥 230601; 2.合肥工业大学 食品与生物工程学院,安徽 合肥 230601; 3.合肥工业大学 分析测试中心,安徽 合肥 230009)

多糖是一种广泛存在于动物、植物以及微生物中的天然生物大分子[1]。文献[2]从不同材料中分离出的多糖皆具有多种生物学活性,包括抗氧化、抗炎、抗肿瘤以及免疫调节活性等。植物多糖具有多种药理活性且无毒性的特点引起了广泛关注,近年来有关植物多糖结构和活性鉴定的研究较多，如具有免疫调节活性的人参多糖[3]、具有抗炎活性的辣木根多糖等[4]。研究表明,植物多糖可作为潜在的功能性食品或药物成分以替代具有明显副作用的化学合成药物。

苍耳子(FructusXanthii)为草本菊科植物苍耳(XanthiumsibiricumPatrinexWidder)的带总苞果实,含有丰富的营养成分,如多糖、亚油酸、苍耳苷以及醇、酯、酸等多种挥发油[5]。作为一种常见中草药,具有抗炎、抗病毒、抗氧化以及抗菌等多种药理作用[6],但由于对苍耳子现有研究较少,其应用与推广受到限制,大大降低了苍耳子的药用价值,造成了资源浪费与经济损失。因此,有必要通过理化性质和生物学活性方面的探索,综合利用苍耳子多糖,以开发保健品和药品。

我国苍耳子分布极其广泛,但目前对苍耳子的研究主要集中于提取优化和化学成分分析[7-8],有关提取方法对多糖理化性质和生物学活性影响的报道并不多。本文旨在以苍耳子作为原材料,通过清除自由基、气相色谱(gas chromatography,GC)以及傅里叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)等方法探究不同方法提取的多糖理化性质和生物学活性的差异,该研究为苍耳子多糖的研究和开发提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苍耳子购自于安徽省亳州市弘扬中药店,并经合肥工业大学王军辉教授鉴定属菊科植物苍耳带总苞果实。

主要试剂有牛血清蛋白、考马斯亮蓝G-250、无水乙醇、正丁醇、三氯甲烷、甲醇、硼氢化钠、水杨酸、氯仿、冰醋酸等，均为分析纯。购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 苍耳子多糖的提取

1.2.1 苍耳子原料预处理

将干燥的苍耳子经高速药物粉碎机粉碎,过80目筛,置于索氏提取器中用丙酮溶液脱色脱脂后烘干备用。

1.2.2 顺序提取苍耳子多糖

将1 g苍耳子粉末与20 mL去离子水混合,沸水提取2 h,过滤获得滤液和滤渣,重复提取2次,再将滤液浓缩、离心、Sevag法脱蛋白、80%乙醇醇沉24 h、透析和冻干,获得多糖WXP。然后将滤渣用2 000 mL浓度为0.05 mol/L的EDTA、醋酸钠和草酸钠溶液在70 ℃下恒温水浴2 h,过滤后重复上述步骤获得螯合剂提多糖CXP。随后,再依次使用0.05、1.00 mol/L的NaOH溶液在4 ℃下浸提滤渣2 h,过滤获得滤液,使用乙酸中和滤液至pH=7,重复提取2次,再将滤液浓缩、离心、Sevag法脱蛋白、80%乙醇醇沉24 h、透析和冻干,获得多糖BXP、AXP。

1.3 苍耳子多糖的理化性质研究

1.3.1 化学成分测定

采用苯酚-硫酸法测多糖质量分数[9],考马斯亮蓝法测定蛋白质质量分数[10],咔唑比色法测定糖醛酸质量分数[11]。

1.3.2 单糖组成分析

根据文献[12]的方法并加以修改,称取5 mg样品于安瓿瓶中,加入4 mL TFA(3 mL TFA和16.5 mL水),封管,110 ℃水解4 h,使用甲醇共蒸除去TFA,再加入3 mL超纯水将水解后的多糖完全溶解,加入30 mg硼氢化钠室温还原3 h后,将过量的硼氢化钠通过25%乙酸中和,使用甲醇共蒸后,放于120 ℃烘箱中30 min以除去水分,再加入4 mL乙酸酐与3 mL吡啶于100 ℃下反应1 h,通过甲苯共蒸以除去乙酸酐,使用3 mL氯仿萃取乙酰化产物,并数次加入等量蒸馏水洗涤氯仿层直至水层澄清,加入适量无水Na2SO4以除尽水分,取1 mL过有机滤膜(孔径为0.22 μm)后移到进样瓶,通过气相色谱(gas chromatography,GC)分析测定苍耳子多糖的单糖组分。

1.3.3 FTIR分析

根据文献[13]的方法并加以修改,采用压片法,使用Nicolet Nexus 67 FTIR光谱仪在 400～4 000 cm-1区内进行红外光谱扫描。

1.4 生物学活性研究

1.4.1 DPPH自由基清除能力

分别配制1 mL的 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL样品溶液,与2 mL 0.02 mg/mL的DPPH-乙醇溶液混合均匀,放于暗处静置反应30 min。在517 nm处测定吸光度,以蒸馏水为空白对照,以Vc为阳性对照。清除率计算公式为:

清除率=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%,

其中:Ai为苍耳子多糖溶液与DPPH溶液的吸光度;Aj为苍耳子多糖溶液与乙醇溶液的吸光度;A0为蒸馏水与DPPH溶液的吸光度。

1.4.2 羟基自由基清除能力

分别配制1 mL的 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL样品溶液,依次加入1 mL 9 mmol/L的FeSO4溶液、1 mL 9 mmol/L的水杨酸-乙醇溶液以及0.05 mL质量分数0.024%的H2O2溶液,37 ℃水浴30 min,在510 nm处测定吸光度。蒸馏水为空白对照,Vc作为阳性对照。清除率计算公式如下:

清除率=[1-(Am-An)/A1]×100%,

其中:Am为苍耳子多糖溶液与反应试剂的吸光度;An为苍耳子多糖溶液与蒸馏水的吸光度;A1为蒸馏水与反应试剂的吸光度。

1.4.3 ABTS自由基清除能力

取10 mL 7 mmol/L的ABTS水溶液与10 mL 2.45 mmol/L的过硫酸钾水溶液混合后避光反应12 h,再使用蒸馏水稀释,至734 nm处吸光度为0.7,得ABTS工作液。分别配制200 μL的1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL样品溶液,各加入4 mL ABTS工作液,避光反应10 min,在734 nm处测定吸光度。以蒸馏水为空白对照,以Vc为阳性对照。清除率计算公式为:

清除率=[1-(As-At)/A2]×100%,

其中:As为苍耳子多糖溶液与ABTS工作液的吸光度;At为苍耳子多糖溶液与蒸馏水的吸光度;A2为蒸馏水与ABTS工作液的吸光度。

1.4.4 细胞培养

在37 ℃、5% CO2的恒温培养箱中,在含有体积分数10%FBS和100 U/mL青霉素的DMEM中培养RAW264.7巨噬细胞,更换细胞液2 d/次。将细胞密度调整至1×105个/mL进行实验。

1.4.5 细胞活力的测定

将细胞以每孔90 μL接种于96孔板中,孵育24 h后,将终质量浓度为12.5、25.0、50.0、100.0、200.0、400.0 μg/mL的样品溶液添加到每个孔中(10 μL),继续培养24 h。培养基作为空白对照。分别加入20 μL的MTT试剂(5 μg/mL)混匀并继续培养4 h,吸除孔板中液体后快速加入200 μL DMSO溶液并避光振动10 min。在570 nm处测定吸光度,并计算增殖指数。

1.4.6 NO的测定

细胞接种方法与1.4.5节相同。接种后培养24 h,将终质量浓度为12.5、25.0、50.0、100.0、200.0、400.0 μg/mL的样品溶液添加到每个孔中(10 μL),孵育2 h后加入1 μL终质量浓度为1 μg/mL的LPS,继续培养24 h后收集上清液。使用Griess试剂进行检测,在540 nm处测定吸光度。本实验中，选用未加LPS的DMEM组为空白对照组，LPS组为阳性对照组。

1.5 统计分析方法

所有实验均重复3次以上,采用Origin 8.0软件作图并进行分析,数据以(平均值±标准差)表示。不同组之间的差异通过单向方差分析(ANOVA)进行评估。统计结果中,*P<0.05表示存在差异，**P<0.01表示差异显著。

2 结果与讨论

2.1 苍耳子多糖化学组成分析

4种多糖组分的化学成分分析结果见表1所列。从表1可以看出，4种多糖组分WXP、CXP、BXP、AXP的总糖质量分数分别为54.2%、68.3%、53.9%、45.9%,蛋白质质量分数分别为12.7%、7.3%、15.4%、21.5%,糖醛酸质量分数分别为9.3%、12.0%、10.3%、5.3%。顺序提取法按提取极性由弱到强的顺序提取苍耳子多糖,因为提取极性的不同,4种提取方法提取多糖的部位也有区别,所以成分上的差异可能是由不同提取方法导致的。

通过GC测定4种苍耳子多糖的单糖组成,可以看出WXP、CXP、BXP、AXP均为杂多糖,WXP、BXP、AXP由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖以及半乳糖组成,CXP由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖及葡萄糖组成,其单糖比例均不相同。已有研究表明,单糖组成及其比例与提取方法密切相关[14]。

通过比较可以发现,WXP中含有大量的木糖,这可能是由于热水提取时,高温使连接于细胞膜表面的糖蛋白脱离,其所含有的木糖被大量释放。碱提多糖BXP、AXP中木糖质量分数均显著降低,但半乳糖质量分数明显增加。半乳糖是细胞壁的主要组成成分,其半乳糖比例的增加可能是由于碱溶液对细胞壁的降解。4种苍耳子多糖均含有高比例的阿拉伯糖,表明阿拉伯糖是构成4种多糖组分主要结构的重要成分。

表1 4种多糖组分的化学组成及其质量分数 单位:%

2.2 FTIR分析

4种多糖的FTIR如图1所示。

图1 4种多糖组分的FTIR谱图

从图1可以看出,4种多糖组分表现出相似的吸收峰,均有显著的多糖结构。4种组分在3 410 cm-1和2 925 cm-1处均有强吸收峰,这主要是由于O—H的伸缩振动和C—H的伸缩振动引起的,这说明苍耳子多糖中均含有大量的羟基[15]。1 650 cm-1附近为C=O的伸缩振动峰,推测多糖中可能含有—CHO。1 420 cm-1处的吸收峰归因于糖环上的O—H变形振动,1 000～1 100 cm-1范围内的存在吸收峰表明存在吡喃糖,860 cm-1附近的信号对应于β-糖苷键。

2.3 生物学活性

2.3.1 抗氧化活性研究

苍耳子多糖的抗氧化结果如图2所示。

图2 DPPH自由基、羟基自由基和ABTS自由基清除率

从图2可以看出,在质量浓度在1.0～5.0 mg/mL范围内,随着多糖质量浓度的增加,4种组分的抗氧化活性呈剂量依赖性提高,当质量浓度为5.0 mg/mL时达到最大。通过比较4种组分在DPPH自由基清除率、羟基自由基清除率、ABTS自由基清除率上的表现,可以看出在质量浓度范围内AXP均表现出优良的抗氧化活性,最高自由基清除率可达到92.7%、77.5%、99.9%。

WXP和BXP除DPPH自由基清除能力略差于AXP外,在羟基自由基和ABTS自由基的清除能力上与AXP相似。而CXP的清除能力明显弱于其他3种多糖。

据报道,糖醛酸质量分数对多糖的抗氧化活性有很大影响[16],然而CXP的潜在抗氧化活性显著低于AXP,已有研究表明抗氧化活性还与半乳糖有关[17],因此这一现象可能是由于CXP缺少半乳糖导致的。而糖醛酸质量分数较低的AXP由于具有高质量分数的半乳糖表现出优良的抗氧化活性。结果表明,半乳糖在抗氧化中起着更为重要的作用。

2.3.2 抗炎活性

4种多糖组分对RAW264.7细胞活性和NO生成的影响如图3所示。

图3 多糖组分对RAW264.7细胞活性和NO生成的影响

从图3a可以看出,与空白对照组相比,4种苍耳子多糖对巨噬细胞均未表现出细胞毒性。在多糖质量浓度较低时(12.5～50.0 μg/mL),CXP与BXP显著促进RAW264.7细胞的增殖;当质量浓度较高时(100.0～400.0 μg/mL),WXP的促进作用明显优于其他多糖。据此,确定苍耳子多糖质量浓度范围25.0～400.0 μg/mL用于后续实验。

从图3b可以看出,加入苍耳子多糖后,NO的产生量明显减少。在质量浓度范围内,4种组分对NO的抑制能力具有明显的质量浓度依赖性,当质量浓度为400.0 μg/mL时,NO的释放量减少近50%。

已有研究发现β-糖苷键是多糖中的主要活性成分[18],FTIR表明CXP具有β-糖苷键,这可能是CXP在缺少半乳糖的情况下依然具有优良抗炎活性的原因。结果表明,苍耳子多糖能有效抑制LPS诱导的巨噬细胞产生NO,达到抗炎的效果。

3 结 论

本文采用顺序提取法提取出4种苍耳子多糖WXP、CXP、BXP、AXP,并研究了提取方法对其理化性质以及生物学活性的影响。结果表明,4种多糖组分的总糖质量分数、蛋白质质量分数以及糖醛酸质量分数存在明显差别。受提取方法影响,4种多糖组分的单糖组成比例均不相同。通过评估苍耳子多糖的生物学活性,发现抗氧化活性与半乳糖质量分数有关,半乳糖质量分数较高的WXP、AXP、BXP展现出较高的抗氧化活性,而缺少半乳糖的CXP的抗氧化活性明显弱于其他3个组分。

在抗炎活性的研究中,4种多糖组分对NO的抑制能力具有明显的质量浓度依赖性,当质量浓度达到400.0 μg/mL时,NO的释放量减少近50%。

研究结果表明,不同提取方法对苍耳子多糖的理化性质与生物学活性产生影响,有必要在分子水平上进一步研究。