异养硝化-好氧反硝化复合菌剂在垃圾渗滤液处理中的应用

高宇轩 ， 靳静晨 ， 高雅娟 ， 张闻天 ， 李晨晨 ， 靳永胜*

1.北京农学院生物与资源环境学院，北京 102206；

2.农业农村部华北都市农业重点实验室，北京 102206；

3.北京环氧环保科技发展有限公司，北京 100028

垃圾渗滤液是垃圾在填埋的过程中产生的成分复杂的特种废水，有机物、NH+4-N、TN等含量均较高，若不进行处理，一旦渗入地下，不仅会污染地下水源［1］，还会随着地下水源的流动污染周边地区，破坏生态环境的同时对人畜健康造成威胁。陈雷［2］对北京垃圾填埋厂地下水污染因子NH+4-N、COD、NO-3-N、总硬度和溶解性固体等进行了分析，结果表明北京地区的地下水已经受到垃圾填埋场渗滤液污染，第四系地层完整未受到破坏的情况下，地下水污染深度在30 m以内。

传统生物脱氮工艺在处理垃圾渗滤液时，往往因为硝化作用和反硝化作用所需环境不同而存在工艺复杂、抗高NH+4-N冲击负荷能力弱、基建成本高、后期运营维护费用高等问题［3］。异养硝化作用是指NH+4-N在氨单加氧酶（ammonia monooxygenase，AMO）和羟胺氧化酶（hydroxylamine oxidase，HAO）的存在下，逐步转化为NH2OH，生成NO-2-N的氧化过程；好氧反硝化作用是指NO-2-N或NO-3-N在硝酸盐还原酶（Nap）和亚硝酸盐还原酶（Nir）的作用下，最终还原为气态氮的过程。具有异养硝化-好氧反硝化能力的微生物能够同步进行硝化和反硝化过程，直接将NH+4-N转化成无害的气态氮排出，使硝化作用和反硝化作用在同一系统中完成，为传统生物脱氮工艺的不足提供了新思路，并且还能去除部分有机物。近年来，学者不断从各种环境中筛选出不同种类的异养硝化-好氧反硝化功能菌株，如粪产碱杆菌（Alcaligenes faecalis）［4］、芽孢杆菌（Bacillus）［5］、恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）［6］、不动杆菌（Acinetobacter sp.）［7］等，这些研究均利用人工配制废水对单一菌株进行异养硝化-好氧反硝化脱氮性能的研究。

近年来有研究证明，相比于单一菌株，混合菌株通过菌株间的协同作用，受抑制性离子和有机物的影响更小，更能适应复杂的环境变化，在实际应用中整个微生物群体更为稳定［8］。但对于单一菌株或复合菌株的研究，大多是利用配制废水、普通废水和养殖废水进行研究，对异养硝化-好氧反硝化菌直接处理垃圾渗滤液的研究较少。本研究利用6株从垃圾渗滤液中筛选到的异养硝化-好氧反硝化菌株进行垃圾渗滤液处理实验，比较单一菌株和混合菌株对垃圾渗滤液NH+4-N、TN和COD的去除效果，并着重研究了复合菌剂在不同碳氮比、活性炭浓度、转速和微量元素浓度下对处理垃圾渗滤液的影响，以期为实际垃圾渗滤液处理工程应用提供技术支持和参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

纳氏试剂购自河南标准物质研发中心；COD使用液A/B购自默克股份有限公司；酒石酸钾钠、过硫酸钾等其他主要试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。恒温摇床DJS-2013R-2（上海世平实验设备有限公司）；超净工作台SW-CJ-2FD（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）；电子天平YP30002（上海越平科学仪器苏州制造有限公司）；紫外可见分光光度计UV-5500（上海元析仪器有限公司）；高压蒸汽灭菌锅MLS-3750（SANYO公司）；离心机22331（Eppendorf公司）；纯水仪LBY（北京龙碧源水处理设备有限公司）。

1.2 菌株来源和培养基

本研究所用菌株均为从垃圾渗滤液中筛选并保存于-80℃的菌种，共6株。分别是热带假丝酵母（Candida tropicalis）JX4、乌克曼柠檬酸杆菌（Citrobacter uckman）Ad5、阿氏芽孢杆菌（Bacillus altenieri）GH9、粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）KH1、地霉（Geotrichum）FH5、松色二孢菌（Disospora pine）H1。垃圾渗滤液采集于北京市阿苏卫垃圾综合处理场。

活化培养基（g·L-1）：七水合硫酸镁 0.05，硫酸铵1.18，柠檬酸钠2.73，红糖6.34，磷酸二氢钾6.00，磷酸氢二钾14.00。微量元素溶液2 mL·L-1。

微 量 元 素 溶 液（g·L-1）：EDTA 35，FeSO4·7H2O 5，H3BO40.014，MnCl2·4H2O 0.99，CuSO4·5H2O 0.25，ZnSO4·7H2O 0.43，无水 CaCl20.19，NaMoO4·2H2O 0.22，CoCl2·6H2O 0.24。

1.3 方法

1.3.1 垃圾渗滤液预处理 在垃圾渗滤液中添加比例为10%的红糖，分别以原始渗滤液（未灭菌）和无菌渗滤液（灭菌）作为两个条件，设定1×105Pa灭菌20 min，30 ℃ 130 r·min-1振荡培养，每24 h取样，以0 h为空白对照（CK），测NH+4-N、TN和COD的变化，连续检测5 d。

1.3.2 单一菌株降解性能测定 将活化后的6株菌以10%的比例分别接入100 mL垃圾渗滤液中，以接入同等比例无菌去离子水的无菌垃圾渗滤液作为CK，实验控制室温为28℃，在转速120 r·min-1条件下进行，均设计3组作为平行对照。每隔1天取样测定其降解率。检测其对垃圾渗滤液的处理效果。

1.3.3 复合菌剂F6降解性能测定 将活化好的6株菌种母液各取50 mL于无菌三角瓶中混匀配置成混合菌剂F6。分别以10%、20%、30%的比例接入100 mL无菌垃圾渗滤液中，对照中以同等比例接入无菌去离子水。实验控制室温为28℃，在转速120 r·min-1条件下进行，均设计3组作为平行对照。每隔1天取样测定其降解率。

1.3.4 不同培养条件下降解特性探究 通过单因素试验，研究了复合菌剂在不同培养条件下对垃圾渗滤液中NH+4-N、TN、COD的去除率，包括C/N、活性炭浓度、转速、微量元素浓度。①在不同C/N实验中，以无菌渗滤液中TN含量为参照，分别按C/N比5∶1、10∶1、15∶1添加红糖和柠檬酸钠（4∶1）的混合碳源。以同等比例添加红糖和柠檬酸钠（4∶1）混合碳源的垃圾渗滤液作为CK；②在活性炭浓度实验中，设定无菌只添加20 g·L-1活性碳、复合菌剂F6添加20 g·L-1活性碳和复合菌剂F6不添加活性碳，共3个处理组；③在转速实验中，设定转速为 130、150、180、200 r·min-1，并以同等转速的垃圾渗滤液作为CK，共做5个处理组；④在不同微量元素浓度实验中，将初始微量元素浓度调整为 0（CK）、1、2、3、4、5、6 µL·L-1，共7个处理组。上述单因素实验复合菌剂F6添加量均为10%，均在28℃条件下，除转速实验其余转速均调整为120 r·min-1，3组作为平行对照，每隔 24 h取样检测渗滤液中NH+4-N、TN、COD的浓度，连续检测5次。分别计算渗滤液中NH+4-N、TN、COD的降解率。

1.3.5 最优降解条件性能验证 调整实验条件为上述各实验中的最优值，将复合菌剂F6以10%比例接种于垃圾渗滤液中，温度设定为28℃，转速为120 r·min-1，3组平行作为对照，在5 d时取样检测渗滤液中NH+4-N、TN、COD的降解率。

1.3.6 分析方法 NH+4-N的测定方法：纳氏试剂分光光度法［6］；TN的测定方法：过硫酸钾双波长分光光度法［6］；COD的测定方法：WTW公司14541试剂盒检测。按公式（1）计算降解率。

1.3.7 数据分析 采用Excel软件对实验结果进行统计分析与绘图。

2 结果与分析

2.1 垃圾渗滤液预处理

垃圾渗滤液成分复杂，其微生物种类丰富多变。从表1可以看出，经过高温灭菌处理后，渗滤液中的NH+4-N、TN、COD浓度均有不同程度的下降，其中COD下降尤其明显，可能是由于在高温条件下，部分NH+4-N和有机碳的挥发和分解所致。从图1可知，未高温灭菌处理的渗滤液，在实验过程中其自身具有一定的降解能力，数据波动较大，这可能与未处理渗滤液本身也含有土著微生物有关。考虑到渗滤液本身微生物可能会使后续实验误差较大，后续实验采用经过高温灭菌处理后的渗滤液。

图1 垃圾渗滤液预处理中TN、NH+4-N、COD的变化Fig.1 Changes of TN,NH+4-N and COD in landfill leachate pretreatment

表1 未灭菌与灭菌后渗滤液原始数据Table 1 Non-sterile and sterilized leachate raw data

2.2 单一菌株降解性能测定

分别将6株异养硝化-好氧反硝化菌株接种到已灭菌的垃圾渗滤液中，测定各菌株对垃圾渗滤液的处理效果。从图2结果得知，6株菌在单个菌株的情况下对垃圾渗滤液中TN、NH+4-N、COD均有不同程度的降解，其中KH1、Ad5对渗滤液中TN、COD的去除效果最好，对TN去除率分别为33.9%和38.63%，COD去除率分别为52.76%和51.72%；H1、JX4对NH+4-N去除效果最好，分别为43.89%和46.03%。

图2 单一菌株对垃圾渗滤液预处理中TN、NH+4-N、COD的降解率Fig 2 Degradation rate of TN,NH+4-N and COD in landfill leachate pretreatment by single strain

2.3 复合菌剂F6降解性能测定

垃圾渗滤液成分复杂，单一的菌种对复杂的垃圾渗滤液处理能力有限，把多株异养硝化-好氧反硝化菌株配制成复合菌剂，可能会提高垃圾渗滤液的处理效果。将6个菌株的菌液按等比例混合成复合菌液F6，在100 mL灭菌后的渗滤液中分别添加10%、20%和30%的F6复合菌液，实验结果如图3所示。结果可知，复合菌剂F6在接种量为10%，5 d时垃圾渗滤液中的TN、NH+4-N、COD去除率分别达到50.88%、59.86%和68.04%。且去除率随复合菌液的接种量增加而提高。接种量提高到30%时，5 d时对TN、NH+4-N、COD的去除率分别达到71.60%、77.41%和97.29%。相比于同样接种量的单一菌株，添加复合菌液F6去除率显著提高。

图3 复合菌剂F6对垃圾渗滤液中TN、NH+4-N、COD的降解率Fig 3 Degradation rate of TN,NH+4-N and COD in landfill leachate pretreatment by compound bacterial agent F6

2.4 不同培养条件下降解特性探究

2.4.1 C/N 碳源是异养硝化-好氧反硝化过程中必需的电子供体，适宜的碳源在生物脱氮过程中起着非常重要的作用。根据灭菌后渗滤液的TN含量，分别按C/N比5∶1、10∶1和15∶1添加碳源，定期取样检测，结果如图4。当补充的碳源量与渗滤液中TN比为15∶1时，其NH+4-N、TN、COD的去除率分别为74.69%、89.23%和83.50%。可以看出，补充碳源能够提高复合菌液对NH+4-N、TN、COD的去除率。

图4 复合菌剂F6在不同碳氮比下对垃圾渗滤液中TN、NH+4-N、COD的降解率Fig 4 Degradation rate of TN,NH+4-N and COD in landfill leachate with compound bacterial agent F6 at different C/N ratios

2.4.2 活性炭浓度 活性碳能为微生物提供附着空间，强化微生物的降解能力［9］。设定条件无菌只添加20 g·L-1活性碳、复合菌剂F6添加20 g·L-1活性碳以及复合菌剂F6不添加活性碳，每天取样检测结果如图5所示。从图5可以看出，无菌只添加活性炭组在5 d内对垃圾渗滤液中TN、NH+4-N、COD的去除都无明显效果。与只添加复合菌剂组相比，同时添加活性炭和复合菌剂F6组能够显著提高垃圾渗滤液NH+4-N、TN、COD的降解率，分别增加了18.46%、20.97%和7.98%。

图5 复合菌剂F6在不同活性炭浓度下对垃圾渗滤液中TN、NH+4-N、COD的降解率Fig 5 Degradation rate of TN,NH+4-N and COD in landfill leachate by compound bacterial agent F6 under different activated carbon concentrations

2.4.3 转速 异养硝化-好氧反硝化菌脱氮需要好氧条件，适宜的溶氧量能促进脱氮效果。本实验通过改变摇床的转速来控制渗滤液中的溶氧量。从图6可以看出，在130～180 r·min-1范围内，溶氧量越高，复合菌株F6对无菌垃圾渗滤液中NH+4-N、TN、COD的去除率越高，最高分别达到81.66%、70.46%和83.39%，当转速增加到200 r·min-1时，其去除率虽然仍呈增长趋势，但是增长速率变小，因此复合菌剂F6处理垃圾渗滤液的最适转速为180～200 r·min-1。

图6 复合菌剂F6在不同转速下对垃圾渗滤液中TN、NH+4-N、COD的降解率Fig.6 Degradation rate of TN,NH+4-N and COD in landfill leachate by compound bacterial agent F6 at different rotational speeds

2.4.4 微量元素浓度 微量元素或参与微生物的生长代谢，或促进酶的活性，在微生物的生命活动中起着重要作用。但过量的微量元素又对微生物有一定的毒副作用。图7结果可知，添加3µL·L-1微量元素母液时，菌剂F6对垃圾渗滤液中TN、NH+4-N、COD去除效果最好，最高为66.08%、78.78%和87.86%，在检测最初的3 d内，微量元素对菌剂F6去除垃圾渗滤液中TN、NH+4-N、COD的区别并不明显，但第4天时开始差距明显。添加3µL·L-1微量元素母液时，菌剂F6对垃圾渗滤液中TN、NH+4-N、COD去除效果最好，比不添加微量元素其降解率分别提高了19.06%、18.28%、18.97%。

图7 复合菌剂F6在不同微量元素浓度下对垃圾渗滤液中TN、NH+4-N、COD的降解率Fig 7 Degradation rate of TN,NH+4-N and COD in landfill leachate by compound bacterial agent F6 at different concentrations of trace elements

2.4.5 最优降解条件性能验证 根据上述实验结果，确定在垃圾渗滤液中控制碳氮比为15∶1、添加复合菌剂F6并设置活性炭浓度为20 g·L-1、转速180 r·min-1、微量元素浓度为3 µL·L-1时，经测定垃圾渗滤液中TN、NH+4-N、COD最高降解率为78.51%、82.39%、90.56%。

3 讨论

垃圾渗滤液成分复杂，除了含有高浓度的TN、NH+4-N、COD、有机物等，其中微生物种类和含量也很丰富，而这些土著微生物中含有一定丰度的具有降解污染物功能的微生物［10］。因此未经高压灭菌处理的垃圾渗滤液原液在实验过程中，对污染物表现出不同程度的降解率。

相比于单株菌，复合菌剂能更好的适应恶劣的环境，表现出对渗滤液中TN、NH+4-N、COD有更高的去除率。复合菌剂F6相比单菌株对垃圾渗滤液中的TN、NH+4-N、COD去除效果都有提升，分别提高了12%、13%、15%。这与已有研究结果［11-13］一致。

一般认为，接种量的多少会影响菌株繁殖的速度，接种量过大会引起溶氧量不足，过小又会影响培养时间，因此适宜的接种量会提高微生物对污染物的去除效果。本研究结果表明随着接种量增加，对垃圾渗滤液的TN、NH+4-N、COD的去除效果越好。在接种量提高到30%时，其对TN、NH+4-N、COD的去除率最高。结果异于相关学者的研究［14-16］，其筛选菌株最适接种量多为5%或10%。可能是因为多数学者是基于人造废水或培养基进行的研究，且为单菌株的最适接种量，而实际的垃圾渗滤液因其污染物种类复杂、含量高等特点，不适宜微生物的快速繁殖，提高接种量增加了实际菌体浓度。

异养硝化-好氧反硝化过程中需要充足的碳源提供能量和电子。碳源是异养硝化-好氧反硝化过程中必需的电子受体，充足的碳源在生物脱氮过程中起着非常重要的作用。补充碳源能够提高复合菌株对NH+4-N、TN、COD的去除率。本研究结果显示，随着碳源的增加，去除率升高。这与赵晶［17］、陈赵芳［18］等研究一致，但赵晶［17］的研究同时表明，当碳源因添加量过多而大量剩余时，会使其中的COD过高而不再降解。因此在实际污水或垃圾渗滤液处理中，适宜的碳氮比尤为重要。

活性炭在污水处理中的应用广泛，具有吸附水中有机物、重金属等有害污染物等的作用，另外还可以作为微生物的挂膜载体，是环保工程中常用的填料［19］。本研究考察了单独添加活性炭和单独添加F6菌剂以及同时添加活性炭和F6菌剂处理垃圾渗滤液的效果。结果显示，活性炭能为微生物提供附着载体，促进微生物的降解功能。这与蒋小丽［20］采用竹炭-微生物联合法去除沼液中的NH+4-N，黄晓龙［21］利用异养硝化菌A.baumannii AL-6与改性核桃生物炭联合去NH+4-N实验研究结果一致，表明炭菌联合在处理垃圾渗滤液时能起到良好的协同作用。

本研究通过改变摇床的转速来控制溶氧量。溶解氧是同时硝化反硝化过程中的主要控制参数，一般当DO高于或者低于某个临界值时，异养硝化活性都会受到抑制。Wang等［22］考察了在F6在转速为130～200 r·min-1之间对垃圾渗滤液TN、NH+4-N、COD的去除能力，结果表明在转速为130～180 r·min-1范围内时，溶氧量越高，其对垃圾渗滤液中TN、NH+4-N、COD的去除率越高，最高分别为81.66、70.46%和83.39%。曾庆梅［23］在研究异养硝化菌Alcaligenes sp.HN-S时发现溶氧量越高越有利于菌株HN-S的硝化脱氮。吴建江［24］通过改变摇床转速来改变培养基中的溶氧量，溶解氧过低时不利于菌体生长，过高时则会引起菌体自溶，使得生物量减少，因而间接影响废水处理的效果。同时吴建江［24］在研究假单胞菌Pseudomonas sp.XS76时发现，转速在 180～200 r·min-1条件下，NH+4-N去除率最高的时间比120 r·min-1缩短了1 d。田雪雪［25］在研究异养硝化-好氧硝化功能菌醋酸钙不动杆菌（Acinetobacter calcoaceticus）N7时发现该菌随着转速的升高，其NH+4-N、TN去除率也逐渐升高，在转速为230 r·min-1时，其NH+4-N、TN去除率达到最大，分别为94.5%和89.8%。因此在实际废水处理过程中，要控制合适的溶解氧以适合微生物的生长，从而提高菌株对于废水NH+4-N的处理效果。

微量元素在微生物的生命代谢中起着重要作用，适宜的微量元素能促进酶的活性，提高微生物对氮元素的硝化和反硝化作用。本实验考察了添加 0～6 µL·L-1微量元素母液，结果表明添加3µL·L-1微量元素母液时，菌剂F6对垃圾渗滤液中TN、NH+4-N、COD去除效果最好。王瑶［26］研究了Mg2+、Mn2+、Fe2+、Cu2+和Zn2+等5种金属离子对粪产碱杆菌C16的生长和脱氮性能的影响，结果表明Mg2+是C16生长和脱氮过程中的一种重要金属离子，但是较高的Mn2+会使C16无法生长，而Fe2+的缺少会抑制C16的生长和NH+4-N的氧化速率，Cu2+则可以避免过量亚硝酸盐的积累，研究同时发现，添加0.1 mmol·L-1Mg2+能促进羟胺氧化酶HAO的活性，0.1 mmol·L-1Cu2+能明显地促进反硝化酶Nar和Nir的活性。刘玉佳［27］考察了微量元素对异养硝化-好氧反硝化菌群（H）、异养硝化菌群（Y）和好氧反硝化菌群（F）共3组混合菌群脱氮性能的影响，结果表明，其中混合菌群H、F在添加了微量元素浓缩液脱氮性能最佳，而菌群Y在不添加微量元素时NH+4-N去除率最高。

本研究结果表明，复合异养硝化-好氧反硝化菌剂F6为高氨氮垃圾渗滤液去除TN、NH+4-N、COD等方面的应用提供了理论基础，具有良好的应用前景。