小鼠10%皮肤软组织缺损创伤后应激障碍抑郁样行为模型的构建及其发生机制探讨

刘立柱 李超艺 林诗炜 曲野

[摘要]目的：探究10%皮肤软组织缺损构建小鼠创伤后应激障碍抑郁样行为模型的可行性，并探讨其发生机制。方法：32只C57BL/6小鼠，雌雄各半，随机分为对照组-雄性，对照组-雌性，创伤后应激障碍-雄性，创伤后应激障碍-雌性，共四组。取创伤后应激障碍组小鼠，背部剃毛，去除背部约10%面积的皮肤软组织，深度达深筋膜层。记录小鼠体重变化，7 d后，取小鼠脑组织用于HE染色，使用ELISA试剂盒检测脑组织中单胺类神经递质5-HT、NE、DA与炎性细胞因子TNF-α、IL-6水平，采用Western blot检测小鼠脑组织中MAOA表达水平。结果：10%皮肤软组织缺损造成小鼠体重短期内迅速下降，与对照组相比，无论雄性还是雌性小鼠，糖水偏好摄取率、穿越平台次数显著减少，悬尾不动时间与强迫游泳不动时间显著增加，差异有统计学意义（P<0.05）。10%皮肤软组织缺损导致小鼠脑组织海马区神经元损伤，炎性细胞因子TNF-α、IL-6分泌水平增加，单胺类神经递质5-HT、NE、DA浓度下降，差异有统计学意义（P<0.05）。与对照组相比，无论雄性还是雌性小鼠脑组织中MAOA表达水平显著增加，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：采用10%皮肤软组织缺损构建小鼠创伤后应激障碍抑郁样行为模型是可行的，其机制可能是通过增加MAOA表达，降低单胺类神经递质5-HT、NE、DA表达水平。

[关键词]皮肤软组织缺损;创伤后应激障碍;单胺氧化酶A;抑郁样行为;小鼠;动物模型

[中圖分类号]R749.99    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2022）05-0098-05

Construction and Mechanism of Depression-like Behavior Model of Post-traumatic Stress Disorder in Mice with 10% Skin and Soft Tissue Defects

LIU Lizhu，LI Chaoyi，LIN Shiwei，QU Ye

（Department of Traumatology，the Second Affiliated Hospital of Hainan Medical College，Haikou 570311，Hainan，China）

Abstract： Objective  To explore the feasibility of constructing a depression-like behavior model of post-traumatic stress disorder （PTSD） in mice with 10% skin and soft tissue defects， and to explore its mechanism. Methods  Thirty-two C57BL/6 mice， male and female in half， were randomly divided into the control group-male， the control group-female， the PTSD-male， and the PTSD-female. The mice in the post-traumatic stress disorder group were shaved on the back， and about 10% of the skin and soft tissue on the back was removed to the depth of deep fascia. Recorded the weight change of the mice. After 7 days， the mice were sacrificed and brains were taken for HE staining， ELISA kits were used to detect secretion of monoamine neurotransmitters 5-HT， NE， DA and inflammatory cytokines TNF-α， IL-6 in the brain. Western blot was used to detect the expression level of MAOA in mouse brain tissue. Results  10% skin and soft tissue defects caused a rapid decrease in the weight of mice quickly. Compared with the Control group， no matter male or female mice， the sucrose preference and the number of crossing platforms were significantly reduced， the time of tail suspension and forced swimming immobility significantly increased， the differences were statistically significant （P<0.05）. In addition， 10% skin and soft tissue defects caused neuronal damage in the hippocampus， increased secretion of inflammatory cytokines TNF-α and IL-6 （P<0.05）， and monoamine neurotransmitters 5-HT， NE， DA concentration were decreased （P<0.05）. Compared with the control group， the expression level of MAOA in the brain tissue of both male and female mice increased significantly （P<0.05）. Conclusion  It is feasible to construct a depression-like behavior model of post-traumatic stress disorder in mice with 10% skin and soft tissue defects. The mechanism may be to increase the expression of MAOA and reduce the expression of monoamine neurotransmitters 5-HT， NE， DA.

Keywords： skin and soft tissue defect; post-traumatic stress disorder（PTSD）; Monoamine oxidase A（MAOA）; depression-like behavior; mice; animal model

創伤后应激障碍（Post-traumatic stress disorder，PTSD）是个体面对异常强烈的身体损害或精神刺激形成的，严重者会出现脑损害的一类精神障碍性疾病[1]。临床特点是症状延迟出现且持久存在，多数患者会表现为长期且持久的抑郁症状。多数报道认为创伤后抑郁情绪的发生率超过15%，创伤后抑郁不仅加大了患者救治困难，而且也加重了患者创伤愈合后重返社会的压力，降低了患者的生活质量[2]。目前，PTSD治疗主要以心理治疗为主，辅以5-羟色胺再摄取抑制剂，如舍曲林、帕罗西汀、氟西汀等药物治疗，以期发挥抗抑郁作用[3]。然而，至今PSTD治疗的机制尚未探究清楚，其原因是PSTD模型尚未完全建立。无论是农耕时期的刀耕火种，还是近现代文明中蒸汽机的发明。火一直都伴随人类文明的进步与发展。然而，火除了给人类带来了巨大便利，也带来了巨大的灾难。据统计，每年约有2 600万人受到不同程度的烧烫伤，严重烧伤患者面临着身体与精神的双重伤害，形成PTSD，多数患者表现出抑郁样症状[4]。若以人作为PTSD的研究对象，由于随访在时间和空间上的限制性，且不符合伦理，评分标准趋于主观性，导致其机制至今仍无法完全探明。所以，探索合理的造模方法构建动物PTSD抑郁模型，研究其病理机制，有利于临床此类疾病的预防和治疗。

1  材料和方法

1.1 实验动物：32只C57BL/6小鼠，SPF级，雌雄各半，10周龄，体质量23～25 g，饲养于SPF动物房内。饲养环境：恒温（24±2）℃，湿度（60±5）%，所有小鼠自由饮食摄水，IVC笼具饲养，每笼不超过4只，雌雄分笼。

1.2 实验材料：戊巴比妥钠（美国Sigma公司）;5-HT试剂盒、NE试剂盒、DA试剂盒（北京索莱宝技术公司）;HE染色试剂盒（北京索莱宝技术公司）;TNF-α试剂盒、IL-6试剂盒（深圳达科为技术公司）;行为学测试仪器与软件（江苏赛昂斯生物科技公司）;Anti-mouse MAOA单克隆抗体（美国Proteintech公司）。

1.3 10%皮肤软组织缺损创伤诱导抑郁模型构建：小鼠适应性喂养1周后，按体重与活跃度随机分为对照组-雄性，对照组-雌性，创伤后应激障碍-雄性，创伤后应激障碍-雌性，每组8只。创伤后应激障碍组小鼠使用3%戊巴比妥钠麻醉，背部剃毛，酒精消毒，使用镊子镊取小鼠背部皮肤，剪刀去除背部约10%面积的皮肤软组织，深度达深筋膜层，裸露皮肤后放回鼠笼中饲养，构建创伤后应激障碍模型，每日监测小鼠体重。对照组小鼠，仅麻醉，背腹剃毛消毒，不做皮肤创伤处理。

1.4 行为学检测：连续7 d观察小鼠状态后，先进行糖水偏好测试，次日再进行旷场测试，悬尾测试与强迫游泳测试，2 d内测完。

1.4.1 糖水偏好测试：根据相关文献进行[5]，正式测试前1 d，所有小鼠进行测试前适应，在鼠笼中分别插入一瓶普通白水与一瓶1%蔗糖水，自由摄水12 h，期间禁食。随后测试，将小鼠单笼饲养，禁水不禁食12 h，每笼插入已分别称重的普通白水和1%蔗糖水。小鼠自由摄水6 h后，再次称量纯水与蔗糖水水瓶重量。计算两次重量差值得到小鼠纯水与蔗糖水消耗量。糖水摄取率=蔗糖水摄取量/（蔗糖水摄取量+纯水摄取量）×100%。

1.4.2 旷场测试：根据相关文献进行[6]，旷场测试装置是一个边长25 cm的正方体，顶端设置一个数码摄像机，用于记录小鼠在旷场测试装置中的活动情况。整个测试时间共6 min，保持整个测试过程中周围环境安静，避光。首先将小鼠自随机位置投入旷场测试箱中，让小鼠自由活动以适应环境2 min，打开数码摄像机记录接下来4 min内小鼠在旷场箱中的活动情况。分析软件将旷场实验装置底部分为25个正方形，记录这4 min内小鼠穿越这25个正方形的次数。

1.4.3 悬尾测试：根据相关文献进行[7]。悬尾箱为25 cm×25 cm×35 cm规格立方体，箱顶板中心绳上连有一个夹子，用于固定小鼠尾尖，使小鼠呈倒悬状态，正前方设置一个摄像机，用于记录小鼠倒悬画面，整个测试时间共6 min，保持整个测试过程中周围环境安静，避光。首先将小鼠尾尖固定于箱顶，身体倒悬，适应环境2 min，打开数码摄像机记录小鼠接下来4 min内的挣扎情况。软件分析以小鼠停止挣扎，紧紧蜷缩身体，维持3 s以上的时间记为静止状态时间，最终加权所有静止状态时间记为悬尾不动时间。

1.4.4 强迫游泳测试：根据相关文献进行[7]。强迫游泳测试装置是一个直径10 cm，水深10 cm的圆柱水池，水温维持在（24±1）℃，顶端设置一个摄像机，用于记录小鼠在水池中游泳情况，整个测试时间共6 min，保持整个测试过程中周围环境安静，避光。首先将小鼠丢入圆柱水池中自由游泳，适应环境2 min，打开数码摄像机记录接下来4 min内小鼠在圆柱水池中的游泳情况。软件分析以小鼠物点不位移的时间记为静止状态时间，最终加权所有静止状态时间记为强迫游泳不动时间。

1.5 HE染色检测小鼠神经元损伤：3%戊巴比妥钠过量麻醉小鼠，仰卧位固定小鼠四肢，沿腹中线打开小鼠胸腔，暴露心脏。自左心室灌注预冷的PBS溶液，剪开右心耳，流出血液。待流出液体无血色，使用预冷的4%多聚甲醛固定脑组织。小鼠出现全身僵硬后，迅速取出脑组织，浸泡于4%多聚甲醛溶液中，4℃储存不少于48 h。取出多聚甲醛中的脑组织，使用不同浓度的乙醇梯度脱水，投入熔融的石蜡中包埋，半自动切片机沿纵冠面连续切片，厚度约5 μm，进行HE染色。取石蜡切片，微波炉中高火烘烤15 min，二甲苯中脱蜡，梯度乙醇由高至低水化。将切片平铺于载玻片上，滴加苏木精染色液，静置5 min，超纯水冲洗。滴加1%盐酸酒精，分化1 s，超纯水冲洗。滴加伊红染色液，复染3 s，超纯水冲洗。梯度乙醇由低至高脱水，二甲苯透化，中性树脂封片，光学显微镜收集图像。

1.6 ELISA检测：3%戊巴比妥钠过量麻醉小鼠，迅速断头处死，取约30 μg海马组织，加入500 μl PBS混合匀浆。离心（12 000 g，30 min），取上清液，用5-HT、NE、DA、TNF-α与IL-6试剂盒检测。

試剂盒测试方法：配置标准品稀释液，根据待测样品数目与标准品数目取出预包被板条，各反应孔内加入80 μl样品或标准品溶液，室温（24℃～26℃）孵育2 h。清洗液洗涤各个反应孔3次，吸水纸拍干孔中液体，各反应孔中加入100 μl生物素抗体工作液，室温（24℃～26℃）孵育1 h。清洗液洗涤各个反应孔3次，吸水纸拍干孔中液体，各反应孔中加入100 μl HRP标记链霉素工作液，室温（24℃～26℃）避光孵育20 min。清洗液洗涤各个反应孔3次，吸水纸拍干孔中液体，各反应孔中加入100 μl TMB显色溶液，室温（24℃～26℃）避光孵育20 min，待反应25～30 min后，各反应孔加入100 μl终止液，5 min内在450 nm处和620 nm处检测各组样品的OD值。根据标准品孔OD值绘制标准曲线，计算出各个组样品细胞因子含量。

1.7 Western blot检测：3%戊巴比妥钠过量麻醉小鼠，迅速断头处死，取海马组织储存于-80℃冰箱中。取冰箱中脑组织，按体积：质量=4：1加入预冷的含PMSF的RIPA裂解液，使用匀浆器在冰上匀浆，形成细胞悬液。吸取细胞悬液，放入4℃冰箱中静置30 min使所有蛋白完全裂解，离心（12 000 rpm，20 min）后取上清。BCA试剂盒检测上清中蛋白浓度，加入RIPA裂解液使所有样品浓度一致。再加入样品1/5体积的5×上样缓冲液，在沸水中煮10 min使蛋白变性。

凝胶电泳：选择预制的10%浓度的SDS-PAGE凝胶，以10 μg蛋白量为标准等量上样。浓缩胶电泳条件为恒压30 V/30 min，分离胶电泳条件为恒压90 V/90 min，整个过程以上样缓冲液到达凝胶底端为终点。以预染蛋白为蛋白分子参照，切取MAOA蛋白凝胶区域，取出PVDF膜进行湿法转膜，转膜条件为恒流2 mA/60 min，以上所有过程保持冰水浴。待MAOA蛋白转移至PVDF膜上，使用4%脱脂牛奶封闭2 h，避免抗原抗体之间非特异性结合，之后以一抗稀释液在4℃条件下孵育PVDF条带过夜。次日使用二抗稀释液常温孵育2 h。最后在PVDF条带上滴加超敏ECL发光液，显影仪下显影，获得目标蛋白条带，以Image J软件分析条带上各组蛋白灰度值，以目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值作为最终定量分析结果。

1.8 统计学分析：本实验结果中所有图表使用Graphpad prism 7.0软件绘制，所有数据以均数±标准差（x¯±s）表示，使用SPSS 22.0软件统计分析，采用One way ANOVA进行分析，以Tukey检验两组之间统计学差异，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2  结果

2.1 10%皮肤软组织缺损创伤对小鼠体重的影响：如图1所示，对照组小鼠，无论雄性还是雌性，随着时间的推移，体重缓慢增加。然而，创伤后应激障碍组小鼠，在10%皮肤软组织缺损创伤构建后1～2 d，无论雄性还是雌性，体重急速降低，在第3天后体重维持不变。

2.2 10%皮肤软组织缺损创伤对小鼠行为学的影响：如图2所示，与对照组相比，无论雄性还是雌性，10%皮肤软组织缺损创伤造成小鼠糖水偏好摄取率、穿越平台次数显著降低，悬尾不动时间和强迫游泳不动时间显著增加，差异均有统计学意义（P<0.05）。

2.3 10%皮肤软组织缺损创伤对小鼠脑组织中神经元状态的影响：如图3所示，对照组小鼠海马神经元染色后轮廓清晰，颜色较浅且有明显的的细胞核。与对照组相比，无论雄性还是雌性，10%皮肤软组织缺损创伤造成小鼠脑组织海马区神经元状态损伤，部分细胞染色较深，细胞核消失。

2.4 10%皮肤软组织缺损创伤对小鼠脑组织中炎性细胞因子的影响：如表1所示，与对照组相比，无论雄性还是雌性，10%皮肤软组织缺损创伤造成小鼠脑组织中IL-6与TNF-α分泌水平显著增加，差异有统计学意义（P<0.05）。

2.5 10%皮肤软组织缺损创伤对小鼠脑组织中神经递质的影响：如表2所示，与对照组相比，无论雄性还是雌性，10%皮肤软组织缺损创伤造成小鼠脑组织中5-HT、DA、NE等单胺类神经递质分泌水平显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）。

2.6 10%皮肤软组织缺损创伤对小鼠脑组织中MAOA的影响：如图4所示，与对照组相比，无论雄性还是雌性，10%皮肤软组织缺损创伤造成小鼠脑组织中MAOA表达水平显著增加，差异有统计学意义（P<0.05）。

3  讨论

PTSD起源于战争，二战后，部分幸存者遭受身体伤害，目睹亲人的离世，经历家园的破坏，出现了PTSD症状。而后，应激事件概念扩展到其他领域，如自然灾害（海啸、地震、洪水等）、火灾、车祸、性侵犯、严重的生理疾病等[1]。中国科学院曾统计汶川地震3个月后，灾区人民都出现了不同程度的PTSD，灾情较轻地区发病率为13.0%，灾情较严重地区发病率则高达37.8%[8]。PTSD常表现为抑郁样状态，探讨PTSD诱导抑郁样行为的机制有利于临床上PTSD的预防与治疗。

烧伤作为临床急症，会诱发包括生理和心理应激反应，重症患者特别是爱美的女性患者会产生包括焦虑、抑郁等异常心理症状[9]。为了探究严重烧伤造成的PSTD抑郁症状的机制，本研究报道通过小鼠背部10%皮肤软组织创伤构建PTSD模型，模拟现实场景中因火灾而容颜尽毁的创伤后应激，探究小鼠出现PTSD抑郁样症状的机制。该模型的理论基础为背部大面积创伤会诱发大量的炎症反应，造成背部疼痛刺激[10]。此外，由于小鼠的好群居习性，背部创伤会导致小鼠之间互相斗殴，群居的习惯破坏，造成心理应激[11]。

本研究中，10%皮肤组织损伤造成了小鼠的体重急剧下降，这与临床上抑郁症患者体重急剧降低的现象一致[12]。此外，小鼠的行为学结果显示，无论雌性还是雄性小鼠，在糖水偏好测试中，都表现出无喜感偏好的症状;在旷场测试中，表现出失去空间探索的欲望;在悬尾测试与强迫游泳测试中，表现出了失去求生的欲望。与此同时，脑组织中提高的炎症反应也是抑郁症患者尸检中经常报道的一种病理症状，且抗炎症的药物如阿司匹林的应用在抑郁症的治疗中也表现出了积极的调理作用[13]。本研究中，10%皮肤组织损伤造成小鼠脑组织中炎性细胞因子表达显著增加。综合以上结果，以10%皮肤组织损伤构建小鼠PTSD抑郁样症状模型成功。

PTSD诱导抑郁样症状机制至今尚未探究清楚，且假说众多。其中单胺假说认为，5-HT、DA、NE等单胺类递质浓度水平会影响脑组织中控制情绪活动区域-边缘系统功能，且会造成抑郁[14]。因此，对于抑郁患者来说，提高中枢神经系统中5-HT、DA、NE等单胺类递质水平是有效的治疗途径之一。单胺氧化酶（Monoamine oxidase，MAO）主要分为MAOA与MAOB两种亚型，MAOA是5-HT、NE、DA等单胺神经递质分解的限速酶。MAOA蛋白与基因水平的增加或减少直接导致作为其底物的单胺类递质的减少或增加。部分临床研究中支持高活性MAOA等位基因与高水平的抑郁样症状的直接关联。此外，MAO抑制剂是应用于临床的第一代抗抑郁药物，人类边缘系统MAOA浓度的调控对抑郁症等精神疾病的发生、发展和转归具有重要意义[15]。本研究中，Western blot检测显示，PTSD组小鼠中MAOA表达水平显著增加，与此同时，5-HT、DA、NE等单胺类递质浓度显著降低。

综合以上实验结果，推论出10%皮肤组织损伤会造成小鼠生理疼痛、生活习性剧变的多面刺激，导致小鼠出现抑郁样症状。其机制与MAOA表达水平增加相关，这会造成小鼠脑组织中5-HT、DA、NE等单胺类递质浓度降低。然而，本研究也存在一定局限性，临床上女性经历的创伤刺激，特别是面部创伤患者，会明显高于男性，这可能与雌激素在创伤后应激诱导PTSD抑郁样症状的动物模型上与临床上存在差异有关[16]。但无论如何，临床上针对PTSD患者预先使用舍曲林、帕罗西汀、氟西汀等抗抑郁药物是合理且有必要的一种手段。

[参考文献]

[1]Neylan T C.Post-traumatic stress disorder and neurodegeneration[J].Am J Geriatr Psychiatry，2020，28（1）：61-63.

[2]陈玥，祝卓宏.接纳承诺疗法治疗创伤后应激障碍综述[J].中国临床心理学杂志，2018，26（1）：205-208.

[3]Ifigeneia M，Odette M V，Caitlin D，et al.Psychological treatments for post-traumatic stress disorder in adults： a network meta-analysis[J].Psychol Med，2020，50（4）：542-555.

[4]Petra M S，Clare S R，Trevor M.Trauma exposure and post‐traumatic stress disorder within fire and emergency services in Western Australia[J].Aust J Psychol，2017，69（1）：20-28.

[5]龐从妃，朱碧仪，蓝雪丹，等.慢性应激大鼠抑郁症模型的建立[J].右江民族医学院学报，2016，38（4）：355-358.

[6]Song M T，Ruan J，Zhang R Y，et al.Astragaloside Ⅳ ameliorates neuroinflammation-induced depressive-like behaviors in mice via the PPARγ/NF-κB/NLRP3 inflammasome axis[J].Acta Pharmacol Sin，2018，39（10）：1559-1570.

[7]Deng X Y，Ji Z Y，Xu B R，et al.Suppressing the Na+/H+ exchanger 1： a new sight to treat depression[J].Cell Death Dis，2019，10（5）：370.

[8]Wang L，Zhang Y Q，Wang W D，et al.Symptoms of posttraumatic stress disorder among adult survivors three months after the Sichuan earthquake in China[J].J Trauma Stress，2009，22（5）：444-450.

[9]刘薇，杨玲，张玉梅，等.音乐干预联合常规护理在重度烧伤成年患者中的应用效果的Meta分析[J].中国美容医学，2021，30（4）：153-158.

[10]杨丽萍，罗艳.12（S）-HETE与皮肤损伤和脑创伤的相关研究进展[J].现代医药卫生，2020，36（17）：2741-2744.

[11]张筱楠，余伟志，薛莹，等.RNA腺苷脱氨酶对社会隔离小鼠攻击行为的缓解作用及5-羟色胺-2C受体机制[J].中华行为医学与脑科学杂志，2020，29（3）：193-199.

[12]黄静文，魏燕燕，刘艳.老年抑郁症患者体重降低的影响因素分析[J].中国医药导报，2021，18（2）：114-117.

[13]Berk M，Woods R L，Nelson M R，et al.Effect of aspirin vs placebo on the prevention of depression in older people： a randomized clinical trial[J].JAMA Psychiatry，2020，77（10）：1012-1020.

[14]Wang Z，Chen L，Zhang L，et al.Paradoxical sleep deprivation modulates depressive-like behaviors by regulating the MAOA levels in the amygdala and hippocampus[J].Brain Res，2017，1664：17-24.

[15]Ziegler C，Domschke K.Epigenetic signature of MAOA and MAOB genes in mental disorders[J].J Neural Transm（Vienna），2018，125（11）：

1581-1588.

[16]Zhang J，Chen L，Ma J S，et al.Interaction of estrogen receptor beta and negative life events in susceptibility to major depressive disorder in a Chinese Han female population[J].J Affect Disord，2017，208：628-633.

[收稿日期]2021-05-06

本文引用格式：刘立柱，李超艺，林诗炜，等.小鼠10%皮肤软组织缺损创伤后应激障碍抑郁样行为模型的构建及其发生机制探讨[J].中国美容医学，2022，31（5）：98-102.