妊娠期肝内胆汁淤积症孕妇胎盘ABCB4基因表达与妊娠结局的关系

赵临潇，左博云，李静亚，于东升

1.延安大学咸阳医院病理科，陕西 咸阳 712000；

2.洛阳市妇幼保健院病理科，河南 洛阳 471000

妊娠期肝内胆汁淤积症(intrahepatic cholestasis of pregnancy，ICP)多于妊娠末3个月发生，临床主要表现为皮肤瘙痒、黄疸，孕妇血清胆汁酸水平明显升高，与此同时血清胆红素、转氨酶、碱性磷酸酶等也有轻度的增高，并在生产后症状迅速消失，实验室指标恢复正常，再次妊娠后可复发[1-2]。ICP孕妇预后往往较好，但可导致早产、胎儿窘迫等一系列胎儿新生儿不良后果，增加围生儿疾病发生率和死亡率，被列为高危妊娠之一[3]。近年来，有研究认为转运体编码基因ABCB4上的突变可能和ICP 的发生关系密切[4]。本研究分析ICP孕妇胎盘组织ABCB4基因表达水平变化，探讨其与妊娠结局的关系，旨在为疾病的防治提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年5月至2020年11月于延安大学咸阳医院分娩的98 例ICP 孕妇纳入ICP组，年龄21～39岁，平均(28.03±3.43)岁；孕次1～4次，平均(2.13±0.57)次；初产妇77例，经产妇21例；发病时孕周≤34 周者19 例，＞34 周者79 例；按照血清总胆汁酸水平将＜40 mol/L 者纳入轻度组(n=61)，将≥40 mol/L者纳入重度组(n=37)。纳入标准：(1)符合中华医学会妇产科学分会ICP诊断标准[5]；(2)年龄≥20岁；(3)单胎妊娠。排除标准：(1)子宫先天畸形、胎位不正；(2)长期生殖道用药；(3)辅助生殖或促排卵受孕；(4)合并免疫或血液系统疾病；(5)合并高血压、糖尿病、甲状腺疾病、慢性肾炎等；(6)合并严重心、肾、肺等脏器疾病；(7)临床资料不全。另选取健康孕妇50例纳入对照组，年龄22～39 岁，平均(28.19±3.29)岁；孕次1～4 次，平均(1.84±0.29)次。ICP组与对照组孕妇的年龄、孕次比较差异均无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准，孕妇及家属知情同意。

1.2 方法 娩出胎盘15 min内采集标本，取母体面中央位置，去掉底部的蜕膜层，取约1 cm×1 cm×1 cm大小的胎盘组织块，注意避开异常组织(例如梗死区、钙化灶、出血处)，10%甲醛固定，采用反转录聚合酶链式扩增(RT-PCR)法测定ABCB4 mRNA 表达水平，以免疫组化法测定ABCB4蛋白表达水平。

1.2.1 ABCB4 mRNA 检测 通过RT-PCR 法，生理盐水洗涤冷冻胎盘组织至无血色，剪碎置于匀浆器，提取总RNA。取2 μg总RNA逆转录酶进行cDNA合成，使用美国7300 实时PCR 系统。内参β-actin 引物 序 列：上 游 引 物5′-CACACTGTGCCCATCTACGA-3′，下游引物5′-TCA GGAGGAGCAATGAT CTTG-3′；ABCB4 引物序列：上游引物5′-CTGCTGGAAAGATTGCAACAG-3′，下游引物5′-GAGCAAAT GAACTCGCATGTC-3′。反应体系及条件：10×PCR缓冲液2.5 μL，d NTP 混合物0.5 μL，10×PCR 缓冲液0.5 μL，上下游引物各0.5 μL；95℃孵育30 s后开启循环：95℃变性(15 s)、60℃退火(20 s)、70℃延伸(10 s)，共40 个循环。测定ABCB4 mRNA 灰度，以β-actin 灰度值作为对照，获得相对量。

1.2.2 ABCB4 蛋白检测 标本4 μm 厚连续切片，脱蜡，梯度酒精脱水，0.01 mol/L 柠檬酸钠抗原修复，室温下3%过氧化氢(H2O2)阻断10 min，磷酸盐平衡生理盐水(PBS)清洗(3 次) 10%的牛血清白蛋白(BSA)浸润，室温下孵育5 min，封闭非特异性位点，加一抗，4℃孵育过夜，PBS清洗(3次)。滴加辣根过氧化物酶(HRP)标记P 物质(SP)，37℃孵育，时长为30 min，PBS清洗3 次，DAB显色10 min，PBS 清洗(3 次)，苏木素复染，盐酸酒精分化后脱水10 min，封片后于镜下观察。随机观察5 个视野，以阳性比例与染色强度判定结果。

1.3 统计学方法 应用SPSS21.0 统计软件分析数据。计量资料符合正态分布，以均数±标准差(x-±s)表示，组间比较采用独立样本t检验，计数资料比较采用χ2检验，等级资料采用秩和检验，采用多因素Logistic 回归分析ICP 孕妇妊娠结局不良的危险因素。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ICP 组与对照组胎盘组织中ABCB4 mRNA与ABCB4 蛋白表达水平比较 ICP 组胎盘组织中ABCB4 mRNA 表达水平明显低于对照组，ABCB4 蛋白阳性表达率明显低于对照组，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表1和图1。

图1 免疫组化法检测ABCB4蛋白在胎盘组织中的表达(×400)

表1 ICP组与对照组胎盘组织中ABCB4 mRNA与ABCB4 蛋白表达水平比较

2.2 轻度与重度孕妇胎盘组织中ABCB4 mRNA与ABCB4 蛋白表达水平比较 重度组孕妇胎盘组织中ABCB4 mRNA 表达水平明显低于轻度组，ABCB4蛋白阳性表达率明显低于轻度组，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

表2 轻度与重度ICP孕妇胎盘组织中ABCB4 mRNA与ABCB4蛋白表达差水平比较

2.3 ICP 组与对照组孕妇的不良妊娠结局比较 ICP 组孕妇的羊水污染、胎儿窘迫、早产、新生儿窒息、围生儿死亡发生率明显高于对照组，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表3。

表3 ICP组与对照组孕妇的不良妊娠结局比较[例(%)]

2.4 影响ICP孕妇妊娠结局的因素 ICP组孕妇中共有46 例出现不良妊娠结局，发生率为46.94%。不同孕次、产次ICP孕妇不良妊娠结局发生率比较差异无统计学意义(P＞0.05)；年龄≥35岁、发病孕周≤34周、疾病程度为重度、ABCB4 蛋白阴性表达、ABCB4 mRNA低表达ICP孕妇不良妊娠结局发生风险高于年龄＜35 岁、发病孕周＞34 周、疾病程度为轻度、ABCB4蛋白阳性表达、ABCB4 mRNA 高表达ICP 孕妇,差异有统计学意义(P＜0.05)，见表4。

表4 影响ICP组妊娠结局的单因素分析[例(%)]

2.5 ICP 孕妇发生不良妊娠结局的独立危险因素 将上述因素差异有统计学意义项纳入多因素Logistic 回归模型，以妊娠结局作为因变量，以上述差异有统计学意义项作为自变量，并进行赋值：年龄(＜35岁=0，≥35 岁=1)、发病孕周(＞34 周=0，≤34 周=1)、疾病程度(轻度=0，重度=1)、ABCB4 蛋白表达(阳性=0、阴性=1)、ABCB4 mRNA 表达(高表达=0，低表达=1)。经多因素Logisitic回归分析结果显示，高龄、发病孕周≤34 周、疾病程度高、ABCB4 蛋白阴性表达、ABCB4 mRNA低表达是ICP孕妇发生不良妊娠结局的独立危险因素(P＜0.05)，见表5。

表5 ICP组孕妇不良妊娠结局多因素Logistic回归分析

3 讨论

临床上ICP发病率为0.2%～20%，且疾病的发生具有明显种族与地域差异，病因较为复杂，多数研究认为，ICP是多因素综合作用下产生的结果，基因遗传易感性决定了个体肝脏对雌激素代谢敏感性[6-7]。

近年来，随着对遗传和分子生物学研究的不断深入，人们发现，肝脏存在胆淤相关基因，如ABCB4 基因、BSEP 基因、FIC1 基因等，均参与肝脏胆汁酸转运与分泌载体等的编码[8]。结构与功能方面，胎盘和肝脏具有一定的相似性，相关研究也表明绒毛和胎盘上均有胆淤相关基因的表达[9]。作为妊娠期特殊器官，胎盘在胎儿物质转运中具有关键性作用，其中包括了胆汁酸的排泌，通常情况下，部分胆汁酸经胎儿肾脏排泄至羊水外，另外大部分胆汁酸则通过胎盘组织屏障转运到母体血液循环中[10]。ABCB4 基因编码的ABCB4 蛋白属于P-糖蛋白超基因家族，主要于肝毛细胆管膜分布[11]。ELSEMIEKE 等[12]研究表明人体ABCB4基因突变可使DMR3蛋白缺乏，胆汁磷脂的分泌减少，导致胆管细胞凋亡或坏死，诱发胆汁淤积。

本研究中ICP 组孕妇ABCB4 mRNA 表达及ABCB4 蛋白阳性率低于对照组，且疾病严重程度高的患者相较于轻度患者ABCB4 mRNA 表达水平及ABCB4 蛋白阳性表达率更低，表明ICP 孕妇胎盘ABCB4基因表达水平相较于正常孕妇明显降低，且其表达水平与疾病的严重程度相关，WEI 等[13]研究结果支持本研究结论。ABCB4 是肝脏毛细胆管膜磷脂输出泵，可将磷脂转运至毛细胆管并与毛细胆管内的胆盐形成微胶粒，使胆管细胞免受胆盐损伤，ABCB4 基因低表达可能导致胆管损伤，从而引起胆汁淤积[14]。相关研究表明ICP 对胎儿健康危害性极大，大大增加了不良妊娠结局风险[15]。本研究中ICP 组羊水污染、胎儿窘迫、早产、新生儿窒息、围生儿死亡发生率均高于对照组，ICP孕妇高胆汁酸使得子宫肌收缩力增加，促进子宫收缩，导致早产发生；高胆汁酸具有毒性作用，可损伤细胞膜、线粒体膜等，生成氧自由基造成呼吸链功能的异常，造成胎儿急性缺氧；胆汁酸可促进胎儿结肠运动，促使胎便排出，导致羊水污染，增加不良妊娠结局风险。进一步分析ABCB4 基因表达水平与临床ICP孕妇不良妊娠结局风险的关系，Logistic回归分析结果显示ABCB4 蛋白阴性表达、ABCB4 mRNA低表达是ICP孕妇不良妊娠结局的独立危险因素。ABCB4 表达下降，DMR3蛋白功能、定位、降解异常，胎盘胆汁酸排泌速度受阻、效率下降，最终使ICP孕妇胎儿因血清胆汁酸明显升高而加大不良妊娠结局风险。

综上所述，ICP孕妇胎盘组织ABCB4基因呈现低表达状态，胎盘组织ABCB4 基因表达水平与妊娠结局关系密切，ABCB4 基因表达水平下降可增加不良妊娠结局风险。