食品中单核细胞增生李斯特氏菌 改良增菌液的研究

◎ 王 乐，陈 佳，秦 丽

（1.张家口市食品药品检验中心，河北 张家口 075000；2.石家庄学院 化工学院，河北 石家庄 050035；3.河北省知识产权保护中心，河北 石家庄 050000）

单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes） 属李斯特氏菌属，革兰氏阳性杆菌，是常见的食源性致病菌。该菌广泛存在于自然界，很容易污染食品[1]。该菌具有嗜冷的特性，可在低氧条件和冷藏环境温度下生长，能在加工厂和家庭冰箱内长时间存活[2]。单核细胞增生李斯特氏菌具有较强的致病性，是一种人畜共患病的病原菌，感染后可导致败血症、脑膜炎、孕妇流产等症状，对于免疫力低下人群感染后病死率可达20%～30%[3]。单核细胞增生李斯特氏菌已经被世界卫生组织食品安全工作计划列为重点监测的食源性致病菌之一，也是我国食源性致病菌监测网中的常规检测项目[4]。各地进行的调查也显示我国不同地区的食品存在不同程度的单核细胞增生李斯特氏菌污染情况。广州市市售食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检出率为1.45%[5]，大理州为2.99%[6]，宝鸡市为8.49%[7]。该菌公共健康危害极为严重，在食品卫生微生物检验中必须加以重视。

目前，对于食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检测方法应用最广泛的是依据《食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验》 （GB 4789.30—2016）的传统培养方法和免疫金标法[8]、生物传感器法[9]、核酸探针法[10]、聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）[11]、环介导等温扩增检测方法[12]以及可视化跨越式滚环等温扩增[13]的快速检测方法。这些检验方法都需要使用高选择性的富集培养基来促进单核细胞增生李斯特氏菌在竞争背景菌群中的生长，以得到相对丰度较高的目标菌体。单核细胞增生李斯特氏菌虽然在自然界中广泛存在，但食品中该菌一般含量较低，且受到加工损伤，不利于后续检验[14]。李氏增菌肉汤（LB1）为选择性增菌液体培养基，含有萘啶酮酸，广谱抗菌，尤其对革兰氏阴性杆菌的抑制生长能力明显[15]。但单纯的选择性富集培养基可能不利于损伤的单核细胞增生李斯特氏菌恢复。因此，对于受到非致死性损伤的单核细胞增生李斯特氏菌需要高营养的选择性培养基进行恢复。

丙酮酸钠有助于受损细胞的修复[16]。酵母浸膏中富含蛋白质、氨基酸类、肽类、核苷酸、B族维生素和微量元素，能够补充氮源和提供微生物生长的多种维生素、氨基酸及生长因子[17]。本研究的目的是通过优化富集培养基中的丙酮酸钠和酵母浸膏含量，达到缩短检测单核细胞增生李斯特氏菌时间的目的。这将在保证检验结果准确度的前提下使食品安全预警时间点前移，大大提高监督工作效率和监督力度，切实保障食品安全。

1 材料与方法

1.1 标准菌株

本研究中使用的单核细胞增生李斯特氏菌（CICC21583）购于中国工业微生物菌种保藏管理中心。

1.2 试剂与仪器

酵母浸膏，美国BD公司；磷酸盐缓冲液、血琼脂、李氏增菌肉汤（LB1）及平板计数琼脂，北京路桥技术股份有限公司；丙酮酸钠（99%），上海安谱实验科技股份有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒、2×PCR Master Mix，天根生化科技北京有限公司；引物及探针，生工生物工程上海股份有限公司。

二级生物安全柜，Synergy HTX；多功能酶标仪，Synergy HTX；恒温培养箱，pHCbi；ME4002E电子天 平，梅特勒-托利多；3K15冷冻离心机，德国Sigma公司；LightCycler 480II实时荧光定量PCR仪，德国罗氏诊断有限公司。

1.3 菌悬液的制备

将-80 ℃保存的单核细胞增生李斯特氏菌CICC21583加入无菌磷酸盐缓冲液中，挑取菌悬液划线接种于血琼脂平板上，36 ℃培养24 h。挑取单个典型菌落再次接种于血琼脂平板上进行传代。挑取活化好的单菌落接种于磷酸盐缓冲液中，振荡均匀，将菌悬液的麦氏浊度控制在0.5～0.6。对上述菌悬液进行10倍梯度稀释，吸取3个连续梯度的100 μL菌悬液接种于平板计数琼脂上，36 ℃培养48 h后计数。每个梯度做3个平行，取平均值。菌悬液的浓度为 1.5×107CFU·mL-1。

1.4 丙酮酸钠添加量的优化

为探究丙酮酸钠添加量对单核细胞增生李斯特氏菌的增菌效果影响，以李氏增菌肉汤（LB1）为基础，分别添加终浓度为0 g·L-1、1 g·L-1、2 g·L-1和3 g·L-1的丙酮酸钠，分装10 mL于灭菌后的试管中。将1 mL 1.3中适宜稀释倍数的菌悬液接种至添加不同浓度丙酮酸钠的李氏增菌肉汤（LB1）培养基。空白培养基作为对照，和接种后的培养基同时放入30 ℃培养箱培养。

1.5 酵母浸膏添加量的优化

在得到最优丙酮酸钠添加量后，以添加一定含量丙酮酸钠的李氏增菌肉汤（LB1）为基础，分别添加终浓度为0 g·L-1、5 g·L-1、10 g·L-1、15 g·L-1和20 g·L-1的酵母浸膏，分装10 mL于灭菌后的试管中。将1 mL 1.3中适宜稀释倍数的菌悬液接种至添加不同浓度酵母浸膏的李氏增菌肉汤（LB1）培养基。空白培养基作为对照，和接种后的培养基同时放入30 ℃培养箱培养。

1.6 单核细胞增生李斯特氏菌OD550值的测定

培养2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h、16 h、18 h、20 h、22 h和24 h后，分别用酶标仪测量550 nm波长下空白培养基和菌悬液的OD550值。以OD550值的大小衡量单核细胞增生李斯特氏菌生物量的多少，得到丙酮酸钠和酵母浸膏的最佳添加量。

1.7 单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法的验证

同时吸取1 mL菌悬液，10倍梯度稀释后接种在平板计数琼脂上，36 ℃培养48 h后计数。

1.8 实时荧光PCR法的特异性验证

采用试剂盒法对培养一定时间后的改良李氏增菌肉汤（LB1）菌悬液进行DNA模板的提取，采用实时荧光PCR法验证其特异性。试验重复3次，设置阳性对照（单核细胞增生李斯特氏菌菌悬液基因组DNA），阴性对照（其他菌菌悬液基因组DNA）和空白对照（无菌水）。

实时荧光PCR检测单核细胞增生李斯特氏菌所用引物和探针为：上游引物5’-CATGGCACCACCAGCATC-3’；下游引物5’-CATCCGCGTGTTTCTTTTCG-3’；探针5’ -FAM-CCGCCTGCAAGTCCTAAGACGCCAECLIPCE-3’；内标探针5’-HEX-ATAGGAGCACTC GCCGCCCACATC-ECLIPCE-3’。最终反应体系为10×PCR缓冲液2 μL；dNTP Mixture（10 mmol·L-1） 1.6 μL；上下游引物各0.4 μL；探针0.6 μL；内标质粒探针0.6 μL；Taq DNA聚合酶0.4 μL；DNA模板 1 μL；去离子水补足20 μL。反应程序为：预变性95 ℃， 4 min；95 ℃，5 s；65 ℃，20 s；45个循环。

2 结果与分析

2.1 丙酮酸钠添加量优化结果

在李氏增菌肉汤（LB1）的基础上添加丙酮酸钠确实能够提升对单核细胞增生李斯特氏菌的增菌效果，但这种积极影响只停留在添加量为1 g·L-1时。如图1所示，当丙酮酸钠的添加量继续增加时，不但没有促进单核细胞增生李斯特氏菌的增加，反而抑制了单核细胞增生李斯特氏菌的生长。当丙酮酸钠添加量为1 g·L-1时，可以观察到0～2 h的延迟期，这相比于未改良的李氏增菌肉汤（LB1）的4 h延迟期得到了缩短。在2 h之后，开始进入对数生长期，生长曲线的斜率明显加大，直至20 h。20 h后单核细胞增生李斯特氏菌的生长进入静止期。

2.2 酵母浸膏添加量优化结果

在同一接种水平下，优化增菌液成分后的单核细胞增生李斯特氏菌生长情况明显好于未改良增菌液中的单核细胞增生李斯特氏菌。如图2所示，在丙酮酸钠添加量为1 g·L-1的基础上优化酵母浸膏的添加量，随着酵母浸膏添加量的增大，增菌效果逐渐提升。添加量为20 g·L-1时增菌效果均优于添加量为15 g·L-1，但增菌效果并未得到明显提升。因此，在增菌效果与成本的综合考虑下，酵母浸膏的最优添加量为15 g·L-1。 最终改良增菌液的优化结果为：在商品化李氏增菌肉汤（LB1）的基础上，添加1 g·L-1的丙酮酸钠，15 g·L-1的酵母浸膏。

2.3 平板计数测定的验证结果

不同丙酮酸钠和酵母浸膏添加量的李氏增菌肉汤（LB1）菌悬液平板计数测定结果与OD550值的变化趋势基本相同，单核细胞增生李斯特氏菌的活菌数随时间增加呈现上升的趋势。未改良的李氏增菌肉汤（LB1）菌悬液中，0～4 h处于延迟期，4～20 h进入对数生长期，20 h后进入静止期，24 h内未进入衰亡期。最终改良李氏增菌肉汤（LB1）菌悬液，0～2 h为延迟期，2～20 h为对数生长期，20 h后进入静止期，24 h之前没有出现衰亡期。不同培养时间下改良李氏增菌肉汤（LB1）菌悬液OD550值如表1所示。

表1 不同培养时间下改良李氏增菌肉汤（LB1）菌悬液OD550值表

2.4 培养时间优化结果

在李氏增菌肉汤（LB1）的基础上，添加1 g·L-1丙酮酸钠时，培养16 h后即可达到未改良李氏增菌肉汤（LB1）培养24 h的菌悬液OD550值，培养时间缩短了8 h。在此基础上，添加酵母浸膏进一步优化增菌液成分，当培养时间为8 h时，就已经达到未改良增菌液培养24 h的效果，增菌时间缩短了2/3。

2.5 实时荧光PCR法的特异性验证结果

将新鲜培养的单核细胞增生李斯特氏菌使用改良李氏增菌肉汤（LB1）培养8 h后，进行实时荧光PCR检测。如图3所示，添加1 g·L-1丙酮酸钠、15 g·L-1酵母浸膏的改良李氏增菌肉汤（LB1）对食品中单核细胞增生李斯特氏菌特异性良好，可以实现食品中单核细胞增生李斯特氏菌的特异性增菌。

3 结论与讨论

食品安全一直是事关民生的国家大事，也是各国普遍关注的焦点。其中，食源性致病菌更是食品安全问题的核心。因此，能够更快速、准确地检测出食品中的食源性致病菌就显得至关重要。

本研究采用单因素实验，发现在李氏增菌肉汤（LB1）中添加1 g·L-1的丙酮酸钠和15 g·L-1的酵母浸膏能够有效提高单核细胞增生李斯特氏菌的菌悬液浓度，缩短前增菌所需时间。应用改良后的前增菌培养液，在培养8 h后即可达到使用未改良前增菌培养液培养24 h的效果，检测时间大幅度缩短，即缩短了食源性致病菌的检测周期，为食品安全监管部门和重大食品安全事件预警提供了技术支撑。