内质网应激对小鼠脂肪组织的影响

么松慧，陈慧，杨洋,3，万悦,4，初源，孙磊，于淼

(1.河北大学 生命科学学院，河北 保定 071002；2.军事医学科学院 生命组学研究所，北京 100850；3.天津大学 化工学院，天津 300072；4.安徽医科大学 基础医学院，安徽 合肥 230032)

内质网是真核细胞中一种重要的细胞器，主要负责蛋白质的折叠和加工[1]，同时也参与糖类和脂类物质[2]的合成，承担细胞内的物质运输工作.当机体受到环境刺激后，细胞内稳态发生变化导致大量未正常折叠蛋白质在内质网中聚集，或者内质网中钙离子稳态失衡时都会诱发内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERs)[3]，激活未折叠蛋白质反应(unfolded protein response,UPR)[4].诱发内质网应激原因除了未折叠蛋白质的累积和钙离子稳态失衡[5]，还包括内质网膜成分的改变、营养物质的变化如葡萄糖的缺失、脂毒性物质侵扰及病毒感染等[6].目前已有大量研究证明，内质网应激反应与众多代谢相关综合性疾病如二型糖尿病[7]、胰岛素抵抗[8]、非酒精性脂肪肝[9]、肥胖[10]等的发生发展有关.近年来有研究指出，内质网应激的发生与脂代谢之间有着密切的联系[11].内质网应激可以影响脂肪细胞的分化[12]、调节脂代谢相关因子的转录水平、影响脂肪酸的合成和甘油三酯的分泌等[13].

衣霉素(tunicamycin,TM)是一种实验中常用的内质网应激诱导剂，可以通过抑制糖蛋白链合成过程进而抑制糖基化的修饰，从而导致大量不能正常折叠的蛋白质在内质网中累积，引发内质网应激.有研究表明，低剂量TM诱导轻度内质网应激的发生可以对细胞产生保护作用，而较高程度且长期的内质网应激则会诱导细胞凋亡.前期实验发现，在使用TM建立内质网应激小鼠模型的过程中，高剂量TM处理组小鼠死亡率偏高，并出现体质量和血糖大幅降低的现象.为了更好地理解内质网应激对脂肪组织的影响，实验中使用2种中等剂量的TM处理小鼠，并在不同时间点观察脂肪组织的变化.研究结果将有助于完善内质网应激与脂肪组织之间的联系，为应激性脂代谢相关疾病的治疗提供参考.

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

TM(上海源叶生物科技有限公司)；GRP78抗体(美国Santa Cruz公司)；CHOP抗体(美国Santa Cruz公司)；游离脂肪酸(NEFA)试剂盒(南京建成)；小鼠瘦素(LEP)ELISA检测试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)；小鼠脂联素(ADP)ELISA检测试剂盒(上海酶联生物科技有限公司).

1.2 实验动物

C57BL/6J的8周龄雄性小鼠，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，饲养于军事医学研究院27号院动物实验中心无特殊病原体(SPF)级动物房.实验前所有实验动物均处于相同饲养环境内，饲养条件均符合实验动物福利伦理标准.

1.3 内质网应激小鼠模型的建立

1.3.1 分组及处理条件

将C57BL/6J小鼠随机分组，每组4～5只.按照小鼠体质量每kg 1.0 mg或1.5 mg的TM对小鼠进行腹腔注射，在注射24、48、72 h后分别处死小鼠，摘取附睾处白色脂肪组织用于后续实验检测.

1.3.2 Realtime-PCR检测内质网应激相关因子mRNA水平

为确认TM处理后小鼠附睾处白色脂肪组织中是否发生内质网应激，通过Realtime-PCR检测白色脂肪组织中内质网应激标志性因子如葡萄糖调节蛋白(Grp78)、C/EBP同源蛋白(Chop)、蛋白激酶样内质网激酶(Perk)、转录激活因子4(Atf4)及转录激活因子6(Atf6)的mRNA水平.利用Trizol法提取小鼠附睾处白色脂肪组织中RNA，使用Thermo反转录试剂盒合成相应cDNA.Realtime-PCR反应体系为：SYBR Green Realtime PCR Master Mix 10 μL、DEPC水3 μL、cDNA模板5 μL、上游及下游引物各1 μL.PCR反应程序为：95 ℃预变性1 min后，95 ℃变性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃ 延伸45 s，共进行40个循环.使用TATA盒结合蛋白(Tbp)为校正内参，PCR所需引物均由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列见表1.

表1 RT-PCR引物序列Tab.1 Primers for RT-PCR

1.3.3 Western blot检测内质网应激相关蛋白表达水平

通过Western blot对TM处理后小鼠附睾处白色脂肪组织中内质网应激相关蛋白GRP78、CHOP的表达情况进行检测，β-actin为内参.取白色脂肪组织加入裂解液后匀浆，12 000 r/min离心10 min，上清液即为总蛋白.在总蛋白中加入5×Loading Buffer煮沸5 min，离心后进行体积分数10%的SDS-PAGE凝胶电泳.电泳结束后在100 mA电压下转膜2 h，随后用质量分数5%的封闭液室温封闭2 h.4 ℃孵育一抗过夜，1×TBST洗膜5 min，重复洗3次；室温孵育二抗1 h，1×TBST洗膜10 min，重复4次.用滤纸吸去膜上多余TBST后加显色液试剂避光显影.

1.4 内质网应激条件下脂肪组织的变化

1.4.1 脂肪病理组织观察

取小鼠附睾处白色脂肪组织，切取0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小组织块置于质量分数12%的甲醛磷酸缓冲盐(PBS)溶液中固定，48 h后送北京基谱生物公司做HE染色.染色结果使用荧光显微成像系统进行扫描，CaseViewer软件统计脂肪细胞直径.

1.4.2 白色脂肪组织中甘油三酯及NEFA含量测定

1.4.2.1 甘油三酯含量测定

取100 mg小鼠附睾处白色脂肪组织(记为m)于EP管中，加入3～5颗磁珠、200 μL三氯甲烷、100 μL甲醇，在组织研磨机中震荡60 s，再加入100 μL甲醇，震荡30 s，震荡后加200 μL水，再次震荡60 s.震荡结束后以12 000 r/min离心10 min.提前将所需新的EP管称质量，记为m0.离心后吸取最下层液体于新EP管中，在烘干机中烘干管内液体.烘干后再次称量EP管质量，记为m1.根据以下公式计算脂肪组织中甘油三酯的质量分数：w(甘油三酯)=(m1-m0)/m.

1.4.2.2 NEFA含量测定

取50 mg白色脂肪组织于EP管中，加入3～5颗磁珠及500 μL PBS后匀浆，12 000 r/min离心10 min后取上清液使用试剂盒检测NEFA水平.

1.4.3 Realtime-PCR检测相关因子mRNA水平

通过Realtime-PCR检测脂代谢相关因子脂肪甘油三酯酯酶(Atgl)、β-2肾上腺素能受体(Adrb2)、脂联素(Adp)、瘦素(Lep)及炎症因子如肿瘤坏死因子-α(Tnfα)、白细胞介素-1β(Il-1β)、白细胞介素-6(Il-6)的mRNA水平.方法如1.3.2中所述，引物序列见表1.

1.4.4 ELISA试剂盒检测脂肪细胞因子水平

小鼠眼球取血，将收集的血液样本3 000 r/min离心10 min,取上清液.使用相应ELISA试剂盒检测血清中ADP及LEP水平.

1.5 统计学方法

实验数据均由GraphPad Prism 8处理，各组间数据比较均采用t检验，N=4～5，当P<0.05时为有显著差异(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.000 1).

2 结果

2.1 内质网应激模型的建立

不同剂量TM腹腔注射小鼠24、48、72 h后，摘眼球取血，随后脱颈处死小鼠，取附睾处白色脂肪组织.利用Realtime-PCR和Western blot检测内质网应激小鼠模型建立成功与否.实验结果显示，与Control组相比，经过1.0、1.5 mg/kg TM处理后，白色脂肪组织中内质网应激相关因子mRNA水平(图1a)大多显著升高(P<0.05)；GRP78、CHOP蛋白表达水平(图1b-c)在处理72 h后均有显著升高(P<0.05).以上实验结果说明：TM诱导的内质网应激小鼠模型造模成功.但是，在内质网应激诱导过程中，1.5 mg/kg处理72 h组出现了小鼠死亡现象，死亡率为40%，其余处理组死亡率均为0.推测死亡原因可能为较高剂量TM激活了细胞凋亡途径，小鼠心力衰竭导致死亡.由此比较认为，使用1.0 mg/kg剂量诱导内质网应激更为适宜.

a.Realtime-PCR检测结果；b.Western blot检测处理72 h后GRP78、CHOP表达情况；c.蛋白表达灰度统计.图1 内质网应激基因mRNA水平与蛋白表达情况Fig.1 mRNA level and protein expression of endoplasmic reticulum stress genes

2.2 内质网应激条件下白色脂肪细胞的变化

TM处理之后，在各组小鼠进食饮水状况相同的情况下，与Control组比较，处理组小鼠的体质量(图2a)大多有显著降低(P<0.05)，并且白色脂肪组织质量与体质量的比例(图2b)均有明显降低(P<0.05).细胞直径统计(图2c)及HE染色结果(图2d)也显示，TM处理后白色脂肪细胞直径大多明显降低，并且在处理72 h后脂肪细胞直径减小最为显著(P<0.000 1).以上结果说明,内质网应激的发生可以降低白色脂肪组织质量与体质量的比例、减小白色脂肪细胞直径.根据以上实验结果推测，这些现象的发生可能是脂肪组织中脂解增多所导致的.

图2 内质网应激条件下小鼠体质量(a)、白色脂肪组织比例(b)和细胞直径(c)的变化及脂肪细胞HE染色(d)Fig.2 Changes of body weight (a),proportion of white adipose tissue (b),cell diameter (c)of mice and HE staining of adipocytes (d) under endoplasmic reticulum stress

2.3 内质网应激对脂解反应的影响

为进一步检测内质网应激是否能引起脂肪组织中发生脂解，在TM处理后不同时间点取小鼠白色脂肪组织进行检测.结果显示，与Control组相比，TM处理72 h后，小鼠白色脂肪组织中甘油三酯含量(图3a)显著降低(P<0.05)，并且脂肪组织中NEFA水平(图3b)显著升高(P<0.05)，由此可证明白色脂肪组织中有脂肪分解发生.同时，RT-PCR结果也显示，TM处理一定时间后，脂肪组织中Atgl和Adrb2的mRNA水平升高(图3c-d)，再次证明脂肪组织中脂解反应增多.以上结果说明，TM诱导的内质网应激促进了脂肪组织中脂肪分解的发生，进而导致脂肪组织质量与体质量的比例降低和脂肪细胞直径的减小.

a.脂肪组织中甘油三酯总量变化;b.脂肪组织中NEFA水平变化；c.d.不同处理脂解因子的mRNA水平.图3 脂肪组织中脂解反应的检测Fig.3 Detection of lipolysis in adipose tissue

2.4 内质网应激条件下，脂肪细胞因子和炎症水平的变化

通过Realtime-PCR和ELISA进一步检测内质网应激条件下脂肪细胞因子和炎症水平变化.实验结果显示，与Control组相比，内质网应激处理组小鼠血清及白色脂肪组织中脂肪细胞因子水平(图4a-b)大多有明显降低(P<0.05)；并且白色脂肪组织中多种炎性因子mRNA的水平(图4c)也部分升高.以上实验结果说明：内质网应激的发生可以导致白色脂肪组织中Adp、Lep水平降低，炎症水平升高.

a.脂肪细胞因子mRNA水平；b.血清中ADP、LEP水平；c.脂肪组织中炎症因子mRNA水平图4 内质网应激条件下脂肪细胞因子水平及炎症水平变化Fig.4 Changes of adipocytokine levels and inflammation levels under endoplasmic reticulum stress

3 讨论

脂肪组织在维持能量物质稳态方面发挥着重要的作用，可以通过感受机体内胆固醇、葡萄糖等水平变化进而调节机体代谢稳态[14].本实验使用TM建立内质网应激小鼠模型，诱导白色脂肪组织中发生内质网应激.结果显示，内质网应激可以影响脂肪组织中的脂代谢.在内质网应激相关因子mRNA水平及蛋白表达升高的情况下，小鼠体质量和白色脂肪组织的比例均有显著降低，白色脂肪细胞直径也明显减小.这与之前多数研究结果是一致的.同时，结果发现内质网应激条件下，脂肪组织中甘油三酯总含量减少，NEFA水平升高，并且脂解反应相关基因mRNA水平升高.脂肪分解释放的NEFA作为一种脂毒性因子，可能会进一步加剧脂肪组织中的内质网应激程度[15]，诱导组织内炎症发生.脂肪细胞分泌的ADP和LEP同为保护性脂肪因子[16]，在脂代谢稳态维持和抑制炎症反应过程中发挥着重要的作用.离体脂肪组织中，ADP能抑制组织内炎症发生[17]；LEP可以通过调控自噬机制抑制炎症小体激活.研究中也发现，内质网应激条件下脂肪组织中Adp、LepmRNA水平降低，炎症水平升高.结果表明内质网应激可以介导脂肪组织中炎症的发生.

此外，综合比较不同处理组的结果发现，1.0mg/kg TM处理72h诱导内质网应激效果最佳.不同程度内质网应激对组织的影响大相径庭，低剂量诱导的轻度内质网应激可以适当激活细胞自噬从而产生一定的保护作用；而高剂量或持续诱导内质网应激则会激活细胞凋亡，导致机体严重损伤甚至死亡[18].1.5mg/kg TM处理组虽然也能成功诱导内质网应激，但在72h的条件下小鼠出现了较高的死亡率，推测可能由于较高剂量TM激活了细胞凋亡途径，小鼠心肌细胞发生凋亡进而心力衰竭导致死亡.因此，1.0mg/kg TM处理小鼠72h诱导白色脂肪组织发生内质网应激的效果最适宜.

综上所述，TM诱导的内质网应激可以导致白色脂肪组织中脂解的大量发生，并且导致脂肪细胞因子分泌减少、炎症反应增多，导致脂代谢紊乱.本研究为内质网应激条件的设立提供了参考意义，并且有助于进一步了解内质网应激与脂肪组织的联系以及应激性脂代谢相关疾病的分子机制.