细胞松弛素B对葡萄糖/质子共转运蛋白GlcPSe的抑制机理

曾晛阳，赵 熹，黄旭日

（吉林大学理论化学研究所,长春 130061）

作为细胞的重要能量来源，并且是蛋白质和脂质合成代谢途径的重要成分，葡萄糖不能通过简单的扩散而通过任何种类的细胞生物膜.因此，葡萄糖转运体（GLUT）作为一种插入膜中的特殊蛋白质，是将葡萄糖带入细胞所必需的.这些转运体涉及一系列常见的疾病，如癌症、糖尿病和血清脑发育相关的疾病.根据结构特点，葡萄糖转运体属于主要促进者超家族（MFS）中的糖转运蛋白家族.MFS是最大的膜蛋白家族之一，其成员存在于生命的各个领域.在人体中，已经发现了14个糖转运蛋白家族的成员，它们在组织分布、表达水平、底物特异性和亲和力方面有所不同，估计是为了适应特定组织的生理需要［1］.其中，大多数人类葡萄糖转运体均为易化扩散蛋白，葡萄糖沿着其浓度梯度跨膜运输，而不依赖任何离子.此外，还有另一类极其重要的葡萄糖/质子的共转运蛋白，如GLUT12［2］人类癌症糖酵解代谢特征的主要葡萄糖转运体，存在于脂肪组织、骨骼肌、小肠和胎盘，还存在于人类乳腺肿瘤、人类前列腺癌和前列腺癌细胞系LNCaP、少突胶质瘤、少突细胞瘤和星形细胞瘤，是一种重要的抗癌治疗靶点.此类葡萄糖转运蛋白的结构和转运机理的研究尚不清晰.但与此同时，已有相关抑制剂类药物对于葡萄糖/质子的共转运蛋白的研究.

为了研究此种重要的共转运蛋白，采用与人源葡萄糖共转运蛋白高度同源的表皮葡萄球菌的葡萄糖/质子的共转运蛋白（GlcPSe），这种蛋白的内向开放、非配位构象结构已被解析［3］.研究表明，表皮葡萄球菌的葡萄糖/质子的共转运蛋白被葡萄糖转运蛋白（GLUTs）的传统抑制剂细胞松弛素B（Cytochalasin B）所抑制.研究表明，细胞松弛素B对于GlcPSe具有抑制效果，其半抑制浓度（IC50）为（18.1±6.3）μmol/L［3］.

GlcPSe与人类的GLUTs存在较高的序列一致性（27%～34%）和同源性（49%～58%）［3］.与大多数MFS成员一样，12个跨膜（TM）螺旋构成了GlcPSe结构的主要部分.在GlcPSe的结构中，残基7-427构成了典型的MFS折叠.葡萄糖结合点位于这两个结构域之间的界面.据了解，当底物结合位点交替暴露在膜的任何一侧时，底物就会发生转移.N端和C端结构域的重新排列和摇摆使GlcPSe从朝外（向周质开放）的构象转移到朝内（向细胞质开放）的构象，以便将葡萄糖从膜的一侧送到另一侧.这种交替进入机制似乎是MFS的所有成员共有的［4］.

葡萄糖转运蛋白的周期性转运过程已有论证［5］.对葡萄糖/质子的共转运蛋白的研究也从葡萄糖结合位点和结构特征上支持了如下转运过程，即转运蛋白上的葡萄糖转运位点交替向膜的一侧开放以供葡萄糖通过.葡萄糖结合位点位于一个被1，4，7和10跨膜螺旋包裹的两性腔内.GlcPSe中的葡萄糖结合位点为Q137（TM5），Q250，Q251，N256（TM7）和W357（TM10）［3］，分别对应人源GLUT1中的残基Q161，Q282，Q283，N288和W388［6］.以上位置是葡萄糖结合的关键，所以抑制剂的结合方式很可能就是通过隔离这些残基与葡萄糖的结合或阻塞葡萄糖的转运通道［7］.

对比采取简单易化扩散方式转运葡萄糖的葡萄糖转运蛋白，葡萄糖/质子的共转运蛋白的TM1和TM4上的残基尤为重要.依据此特点，前人［3］提出了带有葡萄糖/质子的共转运蛋白特征的转运机理机制（Scheme 1）.在无H+的情况下，Asp22（TM1）和Arg102（TM4）形成盐桥，使得TM1和TM4相互靠拢，从而使葡萄糖结合位点所在空腔向胞外开放.当H+与D22结合时，盐桥被破坏，TM1和TM4重新排列以减小空腔的大小，同时这一构象变化降低了葡萄糖/质子的共转运蛋白的构象由向外开放到向内开放的能量障碍，所以当葡萄糖结合时，其因这种构象变化迅速被转运.葡萄糖通过残基与TM5、TM7和TM10的结合，也使得N端和C端两结构域的关系更加紧密.在向内开放的构象中，TM5和TM10远离葡萄糖结合位点，使其上的两个关键残基Q137和W357从葡萄糖的结合位点中脱离，从而使结合位点的空腔向细胞内开放.转运蛋白向内开放，随后葡萄糖被释放，紧接着H+释放，使Asp22和Arg102回到它们的盐桥形式，使葡萄糖结合位点的空腔转变为向外开放.

Scheme 1 Proposed mechanism of glucose/H+symport

葡萄糖转运蛋白在向内开放的构象被认为是抑制剂结合的关键［8］.为了研究抑制剂在葡萄糖/质子的共转运蛋白中的作用机理，同时考察质子化作用对抑制效果的影响，本文使用了GlcPSe的晶体结构（PDBID：4LDS）作为对接和分子动力学模拟（MD）的蛋白质模板结构，通过分子动力学方法，对向内开放构象下的葡萄糖/质子的共转运蛋白在不同质子化情况下与细胞松弛素B的结合进行模拟，计算了抑制剂与蛋白的结合效果，分析了抑制剂在葡萄糖/质子的共转运蛋白在各状态下所起到的关键作用，以及相互结合的分子机制.

1 实验部分

1.1 常规动力学模拟

采用GlcPSe内向构象的晶体结构（PDB：4LDS）作为模型的受体.由于4LDS的晶体结构中缺少N端4个氨基酸，所以本文省略了这一部分.由于4LDS的C端尾巴在葡萄糖转运体中的地位并不明确，对其进行了修补.然后根据H++服务器（http：//biophysics.cs.vt.edu/H++）计算的pKa值，来设定残基的质子化状态，H++服务器是一个基于泊松-波尔茨曼（PB）或广义波恩（GB）模型的大分子中可电离基团的pKa值的计算预测系统.每个残基的质子化状态都是根据pH=7下的pKa计算结果来分配的.GlcPSe与配体对接使用的是Autodock vina［9］.GlcPSe中的配体被设定为中心点，按照Autodock vina的默认参数对蛋白内部的孔腔建立一个网格盒.Glide功能被用来搜索网格定义的结合区域，并产生配体的构象集合.从产生配体的构象中，选择打分最高的构象.在此，对GlcPSe在磷脂POPC分子的膜环境中与抑制剂细胞松弛素B（Cytochalasin B）形成的复合物进行了分子动力学模拟.细胞松弛素B的结构来自于PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/CID：5311281），拓扑结构由网页服务器ATB version 3.0生成（https：//atb.uq.edu.au/）.

使用GROMACS［10～12］对GlcPSe分为两组设置.一组分配质子化状态，另一组不设置质子化状态，并分别将蛋白-抑制剂的复合物嵌入472个POPC分子的膜环境中.为了保证模拟在电中性的环境下进行，在模型的周期性水盒子中加入平衡离子，并设定100 mmol/L氯化钠溶液保证生理条件下的离子浓度.对模型采用最陡下降算法进行能量最小化，之后分别做了100 ps的正则系综（NVT）平衡和1000 ps的等温等压系综（NPT）平衡.过程中，采用GROMOS54A7力场.静电相互作用的计算采用粒子网格埃瓦尔德（PME），库仑截断距离为1.2 nm.对与氢原子相连的键使用LINCS算法进行约束，时间步长为2 fs.在NVT过程中系统温度达到参考温度300 K，时间为0.1 ps.在NPT过程中压力保持1.0×105Pa，采用Nose-Hoover恒温器和Parrinello-Rahman定压器.为了避免偶然性，进行了3次100 ns的MD模拟实验，并且为每次模拟的初始构象分配了满足麦克斯韦-玻尔兹曼分布的不同初始速度.模拟使用GROMACS2020程序包［13］，MD的运动方程采用leap-frog积分算法，能量和坐标轨迹每2 ps记录1次.

1.2 伞形采样模拟

常规分子动力学的最后一帧被用作进一步拉伸分子动力学（Steered Molecular Dynamics，SMD）模拟的初始结构.在拉伸分子动力学之后进行了伞形采样模拟，通过伞形采样模拟得到的结果平均力势（Potential of mean force，PMF）来计算结合自由能.将细胞松弛素B从结合位点向细胞质方向拉伸5 nm.拉伸速率为0.01 nm/ps，弹簧力常数为1000 kJ·mol-1·nm-2.在拉伸分子动力学过程中会为接下来的伞形采样模拟创建一系列初始构型，每个构型与伞形采样模拟中的每一个窗口相对应.伞形采样模拟中配体抑制剂处于简谐势限制下，与蛋白参考分子质量中心（COM）之间的距离借助伞形偏离势而逐渐增加.这种限制可以让配体抑制剂对环境构象空间中指定的区域进行采样，采样沿配体和参考分子质量中心（COM）之间的反应坐标进行.伞形采样模拟的窗口间隔为0.1 nm［14］，在质子化状态下的蛋白模型中取51个窗口，在去质子化的蛋白模型中适当增加了采样窗口为54个窗口.每个窗口都进行了100 ps的NPT预平衡，最后运行了10 ns的伞形采样模拟.最后使用加权直方图分析方法（Weighted Histogram Analysis Method，WHAM）得到PMF并计算结合自由能［15］.

2 结果与讨论

2.1 抑制剂的机制

通过Cheng-Prusoff关系式预估了结合能（ΔGEXP，kJ/mol）［16，17］：

式中：R（8.314 J·mol-1·K-1）为气体常数；T（取310 K）为实验温度.基于热力学的模拟和线性响应的假设，对绝对结合自由能计算使用Linear Interaction Energy（LIE）方法［18，19］，其中ΔUvdW和ΔUel(kJ/mol)分别为配体与周围范德瓦尔斯的平均能量和静电部分在MD模拟中的平均能量.ΔGLIE表示结合态与自由态之间的平均能量差，通过下式计算：

不同的权重系数α和β分别代表非极性和极性的贡献对结合能的贡献.根据经验设定α为0.181［20］.参数β是由从线性响应近似中得出的，其取决于配体的化学性质.Cytochalasin B被归类为带有两个羟基的极性化合物β=0.33［21］.在LIE模型中常数项γ被用于校正能量，以获得绝对结合自由能，与结合位点的疏水性质密切相关［22］.由表1可见，在γ=0时，结合能的实验值与计算值相符.

Table 1 Summary of binding free energy

在100 ns的常规动力学模拟后，分别对葡萄糖/质子共转运蛋白的不同质子化状态［质子化状态（Protonized）和去质子化状态（No protonized）］下的蛋白受体和抑制剂细胞松弛素B进行了方均根偏差分析（RMSD）.两种质子化状态下的蛋白受体在模拟的初始阶段快速达到平衡，均在20 ns之后进入相对平衡的状态（图1）.

Fig.1 RMSD of glucose/H+symporter of two dif⁃ferent proton states

Fig.2 RMSD of cytochalasin B under two different proton states of glucose/H+symporter

质子化状态下的葡萄糖/质子共转运蛋白的RMSD平衡值（约0.6 nm）明显高于去质子化状态，说明其结构表现出了更高的结构柔性，暗示了质子化状态下的蛋白与抑制剂的结合是不紧密的.与之形成鲜明对比的是，抑制剂细胞松弛素B在去质子化状态下的蛋白中表现了高于在质子化状态下的蛋白中的结构柔性（图2），暗示此时细胞松弛素B到达了合适的抑制剂结合空腔，结构得到舒展.此时，抑制剂与去质子化状态下的转运蛋白充分结合.

从构象上观察，去质子化的葡萄糖/质子的共转运蛋白与抑制剂细胞松弛素B的相互作用更加紧密，此时与细胞松弛素B相结合的氨基酸残基包含Pro117，Arg129，Asn136，Gln137，Ile295，Val298，Trp357和Leu380（图3）.在质子化的葡萄糖/质子的共转运蛋白中与细胞松弛素B相结合的氨基酸残基包含Met113，Pro117，Ile144，Ile255，Thr291和Trp357（图4）.细胞松弛素B与去质子化的葡萄糖/质子的共转运蛋白的相互作用明显大于与质子化的葡萄糖/质子的共转运蛋白的结合.观察到抑制剂的结合位点处于葡萄糖转运通道靠近细胞质一侧，抑制剂起到从空间上阻塞葡萄糖转运通道的作用.并且由于Trp357同时是葡萄糖的关键结合氨基酸，同时也是细胞松弛素B的识别位点，其与葡萄糖形成竞争性结合葡萄糖/质子的共转运蛋白的关系，从而抑制葡萄糖的转运.

首先，选取RMSD平衡后50～100 ns的轨迹，对氢键数目进行分析，去质子化状态下细胞松弛素B与蛋白受体形成的氢键可达5个，而后者最多只有3个氢键（图5）.这就表明在去质子化状态下，葡萄糖/质子的共转运蛋白与细胞松弛素B有更强的氢键相互作用，从而结合得更稳定.

Fig.3 Modeled cytochalasin B binding site under no protonized glucose/H+symporter

Fig.4 Modeled cytochalasin B binding site under protonized glucose/H+symporter

Fig.5 Number of hyrdrogen bonds of no protonized(A)and protonized(B)during 50—100 ns

另外，还发现在质子化状态下，Trp357的吲哚和P117的吡咯分别与细胞松弛素B的十四元大环和六元小环上的甲基形成保守的疏水相互作用，当葡萄糖转运蛋白来到去质子化状态下，Trp357和P117均与细胞松弛素B的六元小环形成疏水相互作用，在之后的伞形采样分析中同样得到佐证.也是我们认定的细胞松弛素B与葡萄糖/质子的共转运蛋白的最佳结合状态，并且可以发挥最大的抑制作用.W357（TM10）来自于葡萄糖转运蛋白的C端，P117（TM4）来自于葡萄糖转运蛋白的N端.已知葡萄糖/质子的共转运蛋白是依赖C端和N端向细胞膜两侧交替开放的方式来实现葡萄糖的转运，抑制剂也通过阻碍C端和N端分子动力学的构象变化，使得葡萄糖转运蛋白无法完成由向内开放到向外开放的转变，从而使细胞无法通过转运蛋白吸收葡萄糖.N端结构域的刚性和C端结构域的可变性可能是由它们独特的结构特征所致.已有研究表明N端结构域的内部是亲水的［6］；相反，C端结构域是高度疏水的，这一“多脂的”本质造成了羧基端结构的可变性.在模拟过程中，属于N端结构域的跨膜螺旋几乎采取刚性的动力学运动，而C端结构域中的不连续螺旋体TM10经历了突出的局部重排（图6）.尤其在葡萄糖/质子的共转运蛋白从质子化状态转变为去质子化状态后，TM10在细胞质侧的末端发生弯折，导致Trp357从与尾部的十四元大环产生疏水相互作用，变为与抑制剂中部的六元小环产生疏水相互作用.为细胞松弛素B与更多的残基发生相互作用提供空间上的便利条件（图7）.对TM10的二级结构做了考察，在轨迹稳定的50～100 ns中每10 ns提取一次结构.证实了TM10的Ser351，Trp352和Gly353处，在去质子化状态下更容易形成Turn的二级结构，从而使TM10的末端更容易发生弯折的结构（图8）.

Fig.6 Modeled TM10 under two different proton states of glucose/H+symporter

Fig.7 Modeled zoomed cytochalasin B binding site with TM10 under two different proton states of glucose/H+symporter

Fig.8 Secondary structure changes of TM 10(residues 330—359)under two different proton states of glucose/H+symporter

2.2 质子化的结合位点

通过程序VMD［23］和HOLE［24］显示关键质子化结合位点处于TM1上的Asp22，并非在葡萄糖的转运路径上，离葡萄糖的结合位点也有一定距离（图9），但它的存在不仅对葡萄糖/质子的共转运蛋白转运葡萄糖至关重要，也对抑制剂的结合和抑制作用至关重要.由模拟中50帧构象的折线图可见，在关键质子化位点D22与R102的盐桥距离差异十分明显（图10），表明质子化作用让残基所在螺旋TM1和TM4之间的相对距离发生了不小的变化.

使用程序bio3D程序［25］进一步考察了两种质子化状态下，葡萄糖转运蛋白中的氨基酸残基的运动相关性.发现在去质子化条件下，C端的TM10（resids 330～359）明显地与N端质子化位点相关的TM1（resids 7～33）和TM4（resids 95～123）呈现运动的负相关性（图11）.说明去质子化进程对抑制剂的结合产生了远程的调控作用.与之相反，葡萄糖转运蛋白在质子化条件下，转运蛋白内部的氨基酸之间运动相关变弱.推测质子化状态，作为葡萄糖转运蛋白由“结合底物”到“彻底释放底物”之间的过渡状态，表现出运动相关性短暂“消失”的特性.这时，处于质子化位点的残基失去了对抑制剂结合位点的调控能力.

Fig.9 Position of protonation sites in relation to glucose transport channels

Fig.10 Distance of salt bridge of D22⁃R102 under two different proton states of glucose/H+symporter

Fig.11 Residue cross correlation under two different proton states of glucose/H+symporter

2.3 伞形采样模拟结果分析

Fig.12 Profiles of potential of mean force

通过伞形采样模拟计算了抑制剂细胞松弛素B与葡萄糖/质子的共转运蛋白的结合自由能.结果表明，去质子化状态下葡萄糖/质子的共转运蛋白与细胞松弛素B的结合自由能（E）更高（图12），意味着细胞松弛素B在葡萄糖转运过程中，更加倾向于在处于去质子化状态的阶段发挥抑制作用，其与氢键作用分析结果一致.伞形采样模拟得到的PMF曲线显示，在去质子化状态下细胞松弛素B相对与受体蛋白的拉伸距离（ξ）小于质子化状态下的拉伸距离（图12）.表明在质子化状态下，细胞松弛素B与葡萄糖转运蛋白的结合更加深入.在去质子化状态下Trp357与处于抑制剂中部的六元小环产生疏水相互作用，当在质子化状态下，Trp357已经变为了与抑制剂尾部的十四元大环产生疏水相互作用，这一结合现象导致了质子化状态下的转运蛋白与胞松弛素B的拉伸动力学有更长的拉伸距离.

3 结 论

分子动力学结果表明，转运蛋白在质子化状态下，抑制剂细胞松弛素B与受体蛋白的结合变得更加深入，也更加靠近葡萄糖的结合位点，然而抑制效果却明显不如在去质子化状态下结合转运蛋白.说明抑制剂在葡萄糖/质子的共转运蛋白中有独有的结合方式，并不仅仅是通过空间上阻塞葡萄糖转运通道来达到抑制效果.为了更好地发挥抑制作用，需要在恰当的转运过程中去结合葡萄糖转运蛋白，使抑制剂可以处于最佳结合位置，尽可能多地与转运蛋白建立相互作用.在葡萄糖转运蛋白的构象逐渐向细胞内开放的过程中，当进行到去质子化的步骤，抑制剂细胞松弛素B对葡萄糖/质子的共转运蛋白的抑制作用找到了最佳结合位点.其中Trp357作为识别和结合抑制剂细胞松弛素B的关键氨基酸起到了重要作用.还发现了处于抑制剂结合位点的蛋白局部残基与质子化位点所处的蛋白局部残基之间的运动相关性，证实了质子化位点对抑制剂结合位点的调控能力.通过实验探索，揭示了部分葡萄糖/质子共转运蛋白抑制机理的特点，为针对葡萄糖/质子的共转运蛋白抑制剂的开发和设计提供了理论基础.

感谢吉林大学理论与计算化学实验室在计算方面的支持.