一株烟用产纤维素酶菌株的筛选、鉴定及酶学特性研究

吴旭东，黄仕新，吴 鹏，徐长安，龙 腾 ，唐 旭

（1. 福建中烟工业有限责任公司技术中心，福建 厦门，361021；2. 自然资源部第三海洋研究所，福建 厦门，361005）

0 引言

【研究意义】近年来，卷烟工业企业不断优化提升产品结构，如何进一步提高烟叶质量和可用性、满足卷烟品牌原料需求成为工业企业亟需解决的关键问题。筛选优质的烟用产纤维素酶菌株有助于缓解烟草行业中烟叶的等级结构矛盾、部位结构矛盾和区域结构矛盾。【前人研究进展】纤维素是构成烟叶细胞组织和骨架的基本物质。烟叶中纤维素的含量一般在11%左右，随着烟叶等级的降低而增加[1]。纤维素含量较高时，会使卷烟制品组织粗糙，烟叶燃烧后产生较强的呛咳刺激感[2-4]。微生物及发酵酶制剂技术可以降低烟叶、烟草薄片及烟梗中纤维素等物质的含量，促进其内部大分子有机物质的分解和转化，从而改善品质，减少有害物质产生[5-7]。国内外学者利用生物技术对降低烟叶及烟梗中纤维素进行了大量的研究工作。Gravely等[8]提出用曲霉属（Asetgillusspp.）微生物来降解烟梗中的纤维素方法；叶建斌等[9]利用烟草中分离的类芽孢杆菌（Paenibacillusspp.）对再造烟叶原料进行发酵处理，发现再造烟叶香气增加，刺激性明显减轻，感官品质提升；于少藤等[10]使用从烟叶表面分离筛选到的产纤维素酶菌株（Pseudomonas gessardii）yc10对烟叶进行发酵试验，发现烟叶纤维素降解率达23.49%，总糖含量增加，烟叶中香气成分增加；王莹等[7]和范坚强等[11]从烟草中筛选了多个可降解大分子物质的微生物，并利用所产纤维素酶和果胶酶混合处理烟丝，处理后烟丝纤维素失重率达到41.23%，烟气细腻柔和，香气饱满，能有效提高烟草品质。【本研究切入点】为提高纤维素降解菌在卷烟生产过程中实际应用的可行性。【拟解决的关键问题】以37份片烟样品作为研究对象，通过刚果红染色法初筛，摇瓶液体复筛，测定菌株的CMC酶活，以分离筛选出适用于烟叶原料的高效降解纤维素菌株，通过形态特征观察、生理生化和分子生物学方法，对筛选出的菌株进行菌种鉴定，同时对该菌株所产纤维素酶的酶学特性进行研究，为卷烟工业企业烟叶原料的保值增值提供优质菌种资源。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品 实验所用样品片烟来自云南、福建等国内外烟叶主产区，见表1。

表1 样品片烟来源Table 1 Source of flue-cured tobacco strip samples

1.1.2 培养基 LB培养基：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化钠10 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.2～7.4。

液体富集培养基：羧甲基纤维素钠（CMC-Na）5 g，NH4NO31 g，酵母膏 1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，K2HPO41 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0。

筛选培养基：CMC-Na 5 g，NH4NO31 g，酵母膏 1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，K2HPO41 g，琼脂 18 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0。

产纤维素酶发酵培养基：CMC-Na 5 g，胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化钠10 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0。

1.1.3 主要仪器和试剂 仪器：GR60DF全自动立式高压灭菌锅（厦门致微仪器有限公司），MQT-60R振荡培养箱（上海旻泉仪器有限公司），SW-CJIFD超净工作台（苏州净化有限公司），生化培养箱（宁波莱福科技有限公司），徕卡显微镜DM570（徕卡仪器有限公司）。

试剂：刚果红、3,5-二硝基水杨酸、酒石酸钾钠、苯酚、葡萄糖等常规试剂均为国产分析纯。PCR引物由上海生工合成。细菌基因组DNA提取试剂盒购自上海赛百盛基因有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株的富集与筛选 称取碾碎后的片烟2 g置于50 mL液体富集培养基中，37 ℃、180 r·min-1振荡培养48 h后，取富集后的培养液稀释涂布至筛选培养基平板上，37 ℃培养箱倒置培养48～72 h，再进行刚果红染色，选择生长较好、透明圈较大的菌株接于斜面和LB固体培养基中。

1.2.2 DNS试剂制备 甲液配制：6.9 g结晶苯酚溶于15.2 mL 10% 氢氧化钠，加蒸馏水稀释至69 mL，再加6.9 g 亚硫酸氢钠溶解备用；乙液配制：225 g酒石酸钾钠溶于300 mL 10% 氢氧化钠，加入880 mL 1% 3,5-二硝基水杨酸。将甲、乙液混合于棕色瓶静置7～10 d即可。

1.2.3 粗酶液的制备 将筛选得到的菌株接种于LB培养基中，37 ℃、180 r·min-1振荡活化过夜后，按5%接种于100 mL发酵培养基中发酵24 h，获得的发酵液在 4 ℃、10 000 r·min-1离心 6 min，所得上清液即为粗酶液，后续进行酶活测定。

1.2.4 酶活力测定

1.2.4.1 葡萄糖标准曲线的绘制 取6支10 mL刻度试管并编号，按表2分别加入质量浓度为1.5 mg·mL-1的葡萄糖溶液、蒸馏水和DNS试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。将各管摇匀后，沸水浴10 min，冷却后加纯水定容至10 mL，颠倒混匀后吸取200 μL至96孔板检测OD540值，以葡萄糖质量（mg）为横坐标，扣除空白后的OD540值为纵坐标绘制标准曲线。

表2 葡萄糖标准曲线制作参数Table 2 Parameter of glucose standard curve

1.2.4.2 CMC酶活测定 参考罗燕青等[12]的方法，进行略微改动。在10 mL刻度试管中（3支实验管）加入0.2 mL稀释酶液，加入1.8 mL 1%的CMC-Na溶液（pH 5），摇匀，于60 ℃条件下水浴10 min，取出冷却至室温，加入1.5 mL DNS试剂，迅速混匀后沸水浴反应10 min，冷却后，加水定容至10 mL，轻轻上下摇匀，另取稀释酶液0.2 mL和0.1 mol·L-1pH为5的缓冲溶液1.8 mL作为空白，不加CMC溶液，同样依上述步骤，用空白调零点，于波长540 nm测吸光度值。

酶活力单位定义：在60 ℃，pH 5.0条件下，催化1% CMC-Na每分钟生成1 μg还原糖所需的酶量作为 1 个酶活力单位 U（μg·min-1·mL-1）。

式中G：由标准曲线查得的葡萄糖质量（mg）；N1：粗酶液稀释倍数；N2：比色时反应液稀释倍数；103：毫克与微克的转换；10：酶水解反应时间（min）；0.2：测定酶活力时所用粗酶液的体积（mL）。

1.2.5 菌株的鉴定

1.2.5.1 形态观察及生理生化特性 参照《伯杰氏菌手册》[13]、《常见细菌系统鉴定手册》[14]观察菌株的培养形态、革兰氏染色与芽孢染色，并测定其生理生化特征。

1.2.5.2 分子生物学鉴定 按细菌基因组DNA提取试剂盒（上海赛百盛）提取总DNA，使用标准引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′），1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）扩增 16S rRNA序列，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测为单一明亮条带，切下条带经胶回收试剂盒（上海生工）回收PCR产物送测序公司（广州基迪奥）进行测序，测序结果上传NCBI进行BLAST分析，采用MEGA 5.1软件中的邻接法（Neighbor-Joining）构建系统发育进化树。

1.2.6 纤维素酶酶学特性研究

1.2.6.1 最适反应温度的测定 在10 mL刻度试管中加入稀释酶液与1%的CMC溶液（pH 5）后，于不同温度 30、35、40、45、50、55、60、65、70、75 ℃条件下水浴，其他条件同“1.2.4”的方法，测定不同温度下CMC酶活。

1.2.6.2 最适反应pH的测定 在上一步得出最适温度条件下，设置加入1%的CMC溶液的pH分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，其他条件同“1.2.4”的方法，进行酶活反应测定。

1.2.6.3 酶的热稳定性的测定 在进行酶活反应前，先将酶液分别置于 30、35、40、45、50、55、60、65、70、75 ℃ 温度下保温 30 min，再按照“1.2.4”的方法，进行酶活反应测定。其中以未处理的酶液酶活力为100%，得到该纤维素酶对温度的耐受力结果。

1.2.6.4 酶的酸碱稳定性的测定 在进行酶活反应前，先将酶液分别于pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的缓冲液中，4 ℃保温30 min后，再按照“1.2.4”的方法，进行酶活反应测定。其中以未处理的酶液酶活力为100%，得到该纤维素酶对温度的耐受力结果。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离与筛选

经分离纯化得到的菌株于筛选培养基上培养48 h后，通过刚果红染色，比较水解圈直径（H）和菌落直径（C）大小，选择比值较大的菌株进行复筛，最终得到一株酶活力为56.261 U·mL-1的菌株，编号为FX-1，其刚果红染色结果见表3，纤维素酶水解圈见图1，以此作为后续研究对象。

图1 菌株FX-1纤维素酶水解圈Fig. 1 Cellulase hydrolysis circle of FX-1

表3 FX-1菌株刚果红染色结果Table 3 Congo red staining of FX-1

2.2 菌株的鉴定

2.2.1 菌株的形态及生理生化鉴定 菌株FX-1在LB固体培养基上培养24 h后，菌落为灰白色、干燥、表面有不规则隆起褶皱，边缘毛刺状，结果如图2-A所示；透射电镜观察显示菌体呈棒状或近棒状，长约为 1.6～2.2 μm，粗约 0.8～1.0 μm，多为 2 个或2个以上菌体链状连接，结果如图2-B所示；革兰氏染色阳性，菌体呈现为杆状，芽孢染色为绿色，菌体为红色，芽孢中生，椭圆形，不膨大，结果如图2-C、D所示；其部分生理生化特性见表4。根据这些特征，可初步判断该菌株为芽孢杆菌属（Bacillusspp.）细菌。

图2 菌株 FX-1 形态特征Fig. 2 Morphological characteristics of FX-1

2.2.2 分子生物学鉴定 FX-1的16S rRNA序列长度为1 416 bp，NCBI比对显示FX-1的16S rRNA序列与Bacillus subtilis相似度最高（100%），进一步使用MEGA软件（版本5.1）利用NJ法构建FX-1系统发育树，如图3所示。结果显示FX-1与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、特基拉芽孢杆菌（Bacillustequilensis）（相似度99.79%）处于同一分支，置信度为86%，结合生理生化特征（表4），将FX-1鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。

表4 菌株FX-1的生理生化特征Table 4 Physiological and biochemical characteristics of FX-1

图3 FX-1菌株的系统发育树Fig. 3 Phylogenetic tree of FX-1

2.3 酶活力测定

2.3.1 葡萄糖标准曲线 由图4可见，标准曲线y=0.309 4x-0.010 2，线性相关系数R2为0.998 4，线性良好，可以用于纤维素酶活测定。

图4 葡萄糖标准曲线Fig. 4 Standard curve of glucose

2.3.2 纤维素酶活性分析 用不同发酵时间的粗酶液测定FX-1菌株的CMC酶活力，同时测定相应时间菌株的生长量情况，结果如图5，表明FX-1菌株在发酵48 h时纤维素酶酶活力最高，达56.261 U·mL-1，而其生物量最高时是在36 h。在48 h后，菌株的产酶活性随着生物量的下降而有所降低，在一定时间内二者呈正相关。由此可见，该纤维素酶合成模式属于延续合成型[15]。

图5 培养时间对菌株生长和产酶的影响Fig. 5 Effect of incubation time on growth and enzyme production of FX-1

2.4 菌株FX-1所产纤维素酶的酶活特性

2.4.1 FX-1纤维素酶最适反应温度 以羧甲基纤维素钠为底物，温度为30～75 ℃，测定不同温度下CMC酶活力，结果如图6，表明FX-1所产生的纤维素酶在60 ℃条件下酶活力达最大值，且在30～70 ℃均有活性。这说明该酶最适反应温度为60 ℃，具有良好的耐热性。

图6 FX-1纤维素酶不同反应温度条件下酶活变化情况Fig. 6 FX-1 cellulase activity at different reaction temperatures

2.4.2 FX-1纤维素酶最适反应pH 在得出最适温度条件下，以不同pH的羧甲基纤维素钠溶液为底物，测定CMC酶活力，结果如图7，表明FX-1菌株产生的纤维素酶的最适反应pH为5.0，且该酶在pH 3.0～8.0均有活性，与王霞等[16]获得的地衣芽孢杆菌CMC-4所产纤维素酶适应性pH范围相似，且范围更大，说明该菌株所产纤维素酶pH适应范围较广，具有较好的耐酸性与耐碱性。

图7 FX-1纤维素酶不同pH条件下酶活变化情况Fig. 7 FX-1 cellulase activity under different pH conditions

2.4.3 FX-1纤维素酶的热稳定性 在进行酶活反应前，先将酶液分别置于30、35、40、45、50、55、60、65、70、75 ℃温度下保温30 min，再测定CMC酶活力，结果如图8，表明CMC在30～55 ℃下热稳定较好，相对酶活有90%以上；当在温度≥60 ℃保温30min时，酶活力迅速下降，但相对酶活依然高于30%，说明该酶具有一定的耐热性。

图8 FX-1纤维素酶在不同温度环境下的耐受情况Fig. 8 Tolerance of FX-1 cellulase to elevated temperatures

2.4.4 FX-1纤维素酶的酸碱耐受能力 在进行酶活反应前，先将酶液分别于pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的缓冲液中，4 ℃保温30 min，再测定CMC酶活，结果如图9，表明pH 为3.0～7.0，CMC酶较稳定，当pH为8.0时，酶活迅速下降，但相对酶活依然高于60%，说明该酶具有一定的耐酸碱能力，但主要过程pH值还是较为偏酸性，可知该酶为酸性酶[17]。

图9 FX-1纤维素酶在不同酸碱环境下的耐受情况Fig. 9 Tolerance of FX-1 cellulase to acidic and alkaline conditions

3 结论与讨论

纤维素降解菌广泛分布于自然界，细菌、真菌、放线菌等微生物在一定条件下都能合成、分泌纤维素酶[18]。细菌是微生物中种类最多，数量广泛的类群。与真菌相比，细菌生长更迅速，环境适应能力更强，其中芽孢杆菌具有良好的稳定性、环境适应性以及产酶活性高等优点，有利于工农业应用[18,19],，也更适于烟草行业。目前，关于芽孢杆菌产纤维素酶活性的研究多有报道，如薛磊等[20]研究发现芽孢杆菌属细菌是云南烟草种植区的优势菌群，筛选到的芽孢杆菌YN14产纤维素酶活性高；Abd等[21]在对土壤和灌溉水产纤维素酶细菌的分离筛选研究中，发现能够分泌纤维素酶的40株菌株中，纤维素酶活力最高的5株菌皆为芽孢杆菌；Yang等[22]表明在所有的纤维素分解细菌分离物中，蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的纤维素酶活性最高。

分离筛选到可有效降解纤维素的纤维素酶高产菌株是实现应用的前提。本研究从37份片烟样品中分离筛选到了一株产纤维素酶菌株FX-1，该菌株能在以羧甲基纤维素钠（CMC）为唯一碳源的培养基上生长，刚果红染色后有明显的透明圈。菌落为灰白色、干燥、表面有不规则隆起褶皱；透射电镜观察显示菌体呈棒状或近棒状的杆菌；部分生理生化测试结果显示菌株FX-1为革兰氏阳性，接触酶实验阳性，V-P试验测定阳性，能还原硝酸盐和柠檬酸盐。上述形态观察和生理生化特征与芽孢杆菌属Bacillus细菌的表型特征相似。从16S rRNA序列与Bacillus subtilis相似性（相似度最高100%）和系统发育进化树分析，FX-1与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、特基拉芽孢杆菌（Bacillus tequilensis）（相似度99.79%）处于同一分支，置信度为86%。综上，结合生理生化、16S rRNA基因序列同源性、系统发育树等方面分析，将FX-1初步鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。

从枯草芽孢杆菌FX-1产纤维素酶的生长特性可以看出，发酵48小时，纤维素酶酶活性可以达到56.261 U·mL-1。此前很多烟草源产纤维素酶菌株的筛选研究中，杨宗灿等[23]从原烟表面分离筛选得到的烟叶纤维素降解菌株XC-19-1，其发酵产纤维素酶活性为6.6 U·mL-1；邹芳等[24]从烟稻轮作区获得的枯草芽孢杆菌YC-2的CMC酶活力为38.65 U·mL-1；梅金飞[25]从烟草秸秆废弃物中获得的嗜热芽孢杆菌SL-2A的 CMC最大酶活力为 48.72 U·mL-1。可见枯草芽孢杆菌FX-1具有较高的纤维素酶活性。对其酶学特性研究也表明，FX-1菌株所产纤维素酶活稳定，在pH 3.0～7.0、温度30～55 ℃保温30 min后仍有较高活力，说明其具有较强的耐酸能力和耐热能力。该酶催化的最适pH值为5.0，最适温度为60 ℃，可知该酶为中温酸性酶。综上，本研究所得菌株FX-1是1株能高产酸性纤维素酶的枯草芽孢杆菌，经进一步开发后，将在烟草行业中具有良好的产业化应用前景。