桑叶生物碱对D-半乳糖诱导小鼠肠道屏障损伤的改善作用及机理

贺 燕，黄先智，韦 峥，郝麒麟，丁晓雯,*

（1.西南大学食品科学学院，重庆 400716；2.西南大学科技处，重庆 400716）

肠道不仅是体内营养物质消化吸收的关键场所，还是重要的屏障防御系统，能够抵抗外来有害物质侵入肠道，同时阻止肠腔内细菌及毒素进入体内对机体造成伤害[1]。肠道屏障是抵御有害刺激的第一道防线，由肠上皮细胞及细胞间紧密连接、黏液层等构成[2]。由于肠上皮组织位于机体与肠腔的界面处，因此易受到饮食、药物或有害物质等刺激产生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS），引发氧化应激，最终导致上皮细胞凋亡或紧密连接蛋白结构受损，肠道屏障完整性被破坏[3-4]。目前常通过摄入化学合成药物治疗肠道疾病，但药物易刺激肠道而造成二次伤害[5]。因此，探究安全、无毒的天然活性物质对肠道损伤的改善作用成为研究热点。

生物碱是一种重要的天然活性成分。已有研究表明生物碱类物质如小糪碱[6]、苦参碱[7]等，可显著减轻肠道黏膜损伤和肠细胞坏死，并能上调紧密连接蛋白的表达水平，改善肠道屏障损伤。桑叶生物碱是一类从桑叶中分离得到的、以1-脱氧野尻霉素为主要成分的哌啶烷类生物碱，具有水溶性好、生物活性高、无细胞毒性的特点[8]。大量研究已证实桑叶生物碱具有显著的抗氧化功效，能够增加抗氧化酶的活力及非酶抗氧化剂的含量，减轻机体的氧化应激损伤[9-10]。王祖文[11]证实桑叶生物碱能够改善肝脏损伤，该研究通过苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色法对肝纤维化小鼠的肝组织切片进行病理学观察，显示桑叶生物碱可显著改善模型小鼠中肝细胞排列紊乱、肝小叶结构模糊、胶原大量沉积等现象，改善小鼠肝纤维化现象。考虑到目前鲜有关于桑叶生物碱对肠道损伤的改善作用及机制的研究报道，本研究以D-半乳糖（D-galactose，D-Gal）诱导建立小鼠肠道损伤模型，通过对肠组织切片进行病理学观察，以及测定3种重要的紧密连接蛋白（闭合蛋白（Occludin）、Claudins、ZO-1）的mRNA表达水平，探讨桑叶生物碱对肠道屏障损伤的改善作用及作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物、材料及试剂

SPF级4周龄雄性昆明种小鼠60只，体质量为（20±2）g，购于湖南省斯莱克公司（生产许可证号：SCXK（湘）2016-0002）。基础饲料购买于重庆医科大学实验动物中心。

桑叶粉末 重庆市蚕业科学技术研究院；D-Gal（纯度≥99%）、还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）（纯度≥98%） 北京索莱宝有限公司生产；D-乳酸（D-lactic acid，D-LA）、二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、肠型脂肪酸结合蛋白（intestinal fatty acid binding proteindityrosine，iFABP）酶联免疫吸附试验试剂盒、HE染色试剂盒 上海优选生物科技有限公司；高纯总RNA快速提取试剂盒 北京百泰克生物技术有限公司；反转录试剂盒、SYBR®Premix ExTaqTMII（Til RNaseH Plus）试剂盒 宝生物工程（大连）有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

Symergy H1酶标仪 美国Christ公司；5880型冷冻离心机 德国Eppendorf公司；DW-HL438型超低温冰箱合肥美菱股份有限公司；NanoDrop ND-2000C型微量紫外分光光度计 美国赛默飞世尔公司；DYY-6C型电泳仪 北京六一生物科技有限公司；T100T型聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪、GelDoc2000型凝胶成像系统 美国Bio-Rad公司；qTOWER3G型实时荧光定量PCR仪 德国耶拿公司。

1.3 方法

1.3.1 桑叶生物碱的制备和实验动物的分组

桑叶生物碱为实验室自制[10]，通过硅钨酸沉淀法[12]测得总生物碱含量为（935.71±64.26）mg/g。此外桑叶生物碱多糖含量为（32.14±1.93）mg/g，黄酮含量为（21.97±1.69）mg/g。

本研究严格遵守西南大学《实验动物保护和使用规则》。小鼠饲养在可自由进食和饮水的塑料笼中，每笼4～5只，控制动物房温度（22±2）℃、相对湿度50%～70%、12 h明暗交替（8∶00～20∶00）。适应性喂养7 d后，随机选取15只小鼠作为正常组，每天腹腔注射10 mL/kgmb生理盐水；其余55只小鼠作为造模组，每天腹腔注射1 000 mg/kgmbD-Gal（注射体积为10 mL/kgmb）。连续注射45 d后分别从正常组和造模组随机选取5只小鼠，麻醉后眼球取血，颈椎脱臼处死，收集血清，取出1只正常组小鼠和5只造模组小鼠的小肠组织并切取小肠组织中段2～3 cm固定在质量分数10%的福尔马林溶液中，以进行切片和病理学观察，测定血清中丙二醛、D-LA浓度和DAO活力，用于初步判断小肠氧化损伤的情况。通过HE染色观察小肠组织的病理学表现。综合判断小鼠小肠损伤模型是否成功。

保留10只正常组小鼠，将造模成功的50只小鼠随机分为模型组，阳性对照组（每天灌胃200 mg/kgmbGSH），桑叶生物碱低、中、高剂量组（分别每天灌胃50、100、200 mg/kgmb桑叶生物碱，桑叶生物碱剂量根据前期预实验确定，且经过毒理学实验表明，高剂量的桑叶生物碱无毒副作用）。正常组和模型组每天灌胃生理盐水，各组灌胃体积均为10 mL/kgmb，持续灌胃45 d。实验期间，观察小鼠的活动情况并记录，每周测定小鼠体质量。

1.3.2 测定样本的采集与制备

最后一次灌胃结束后，各组小鼠禁食不禁水16 h，乙醚麻醉后眼球取血于采血管中，静置2 h后于4 ℃、3 000 r/min离心10 min，收集血清并于－80 ℃下保存备用。小鼠采血后颈椎脱臼处死，立即取出小鼠小肠段组织，用预冷的4 ℃生理盐水洗净，吸水纸吸干表面水分后称质量。

切取小肠组织中段2～3 cm固定在质量分数10%的福尔马林溶液中，以进行切片和病理学观察；剩下小肠段组织放入RNase free离心管中，－80 ℃保存，用于总RNA提取。

1.3.3 血清指标测定

血清中D-LA、DAO、LPS、iFABP水平的测定均分别按照试剂盒说明书进行。

1.3.4 小肠组织病理学观察

将小肠组织经石蜡包埋后的标本切成4 μm厚的切片，并用HE染色。光学显微镜观察小肠组织的形态学变化。

1.3.5 小肠组织总RNA提取及反转录

按照试剂盒说明提取小肠组织RNA，检测其质量合格后按照试剂盒方法反转录为cDNA。

1.3.6 实时荧光定量PCR

反应体系按照SYBR Green染料说明书操作配制，扩增程序：预变性94 ℃、4 min；变性95 ℃、15 s，退火60 ℃、31 s，延伸72 ℃、20 s，40个循环。扩增结束后根据熔解曲线评估引物特异性，根据扩增目的基因及β-actin的Ct采用2-ΔΔCt法计算各目的基因的相对表达量，引物序列见表1。

表1 引物序列信息Table 1 Primer sequences information

1.4 实验数据处理与分析

实验结果均以平均值±标准差表示，采用SPSS 22.0软件对结果进行单因素方差分析，采用Duncan检验进行多组样本间差异显著性分析，P＜0.05表示差异显著。采用Origin 2018软件作图。

2 结果与分析

2.1 D-半乳糖诱导建立小鼠肠道损伤模型的结果

连续45 d腹腔注射1 000 mg/kgmbD-Gal后，分别测定正常组和造模组小鼠血清中丙二醛、D-LA浓度和DAO活力，并通过HE染色观察小肠组织的病理学表现，结果如表2、图1所示。

表2 小鼠血清中丙二醛浓度、D-LA浓度、DAO活力Table 2 Concentrations of malondialdehyde and D-LA and activity of diamine oxidase in serum of mice

图1 实验小鼠小肠组织的病理学表现（×200）Fig. 1 Pathological manifestations of small intestinal tissue in experimental mice (× 200)

由表2可知，正常组与造模组中丙二醛浓度、D-LA浓度和DAO活力存在显著差异，初步提示肠道可能发生氧化应激损伤[13]。由图1可知，正常组中小肠组织结构完整，细胞间紧密排列，造模组中小肠组织出现大量破碎、坏死细胞，提示小肠遭受严重损害。综上，可判断造模成功。

2.2 桑叶生物碱对小鼠生长发育的影响

小鼠生长发育是否良好可通过其外观状态、活动情况、体质量来判断。造模结束时，与正常组小鼠相比，造模组小鼠活动变少，出现脱毛、毛色发黄等症状。这些症状在阳性药物和桑叶生物碱干预45 d后大大减轻。灌胃期间桑叶生物碱对小鼠体质量的影响如图2所示。

图2 桑叶生物碱对小鼠体质量的影响Fig. 2 Effect of mulberry leaf alkaloids on body mass in mice

如图2所示，虽然各组小鼠的体质量在灌胃期间均呈增加趋势，但与正常组相比，模型组小鼠体质量增加速率较慢，表明造模期间连续注射D-Gal可能造成后期不再给予D-Gal时小鼠体质量增长缓慢，小鼠生长发育受阻。灌胃结束时，与正常组相比，模型组小鼠体质量下降了15.31%。阳性对照组小鼠体质量较模型组增加了8.87%，但明显低于正常组，表明灌胃GSH能促进小鼠体质量的增长，但未能使之恢复至正常水平，这可能与GSH具有较好的降脂功效，一定程度上控制了小鼠体质量的增加有关[14]。与模型组相比，桑叶生物碱低、中、高剂量组小鼠体质量分别增加了2.42%、10.12%、15.66%，且高剂量组小鼠在灌胃结束时体质量恢复至正常组水平，表明连续灌胃桑叶生物碱可有效改善小鼠生长受阻的现象。

2.3 桑叶生物碱对实验小鼠血清中D-LA、LPS、iFABP和DAO水平的影响

肠道屏障的完整性通常用肠道通透性来衡量[15]。当肠上皮细胞或紧密连接蛋白结构受损时，肠通透性升高，肠屏障对物质的选择渗透性能下降[16]。DAO是一种催化组胺二胺氧化的关键酶，iFABP是一种细胞内蛋白，这两种物质均位于肠上皮细胞中[17-18]。研究表明ROS可直接作用于肠上皮细胞，使细胞膜上的磷脂双分子层发生脂质过氧化而损伤膜结构，导致DAO和iFABP释放入血液[19]。D-LA是肠道内细菌糖酵解途径的代谢产物[20]，LPS是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分，是导致宿主炎症反应的关键物质[21]。当肠道屏障被破坏，肠通透性增加，细菌发生移位，D-LA和LPS随之扩散到血液循环中[22-23]。因此，血清中D-LA、LPS、iFABP水平及DAO活力可反映肠屏障完整性和通透性的变化[24]。桑叶生物碱对血清中D-LA、LPS、iFABP水平及DAO活力的影响如表3所示。

表3 桑叶生物碱对小鼠血清D-LA、DAO、LPS、iFABP水平的影响Table 3 Effect of mulberry leaf alkalois on levels of D-LA, DAO, LPS and iFABP in serum of mice

由表3可知，与正常组相比，模型组小鼠血清中D-LA、DAO、LPS、iFABP水平分别显著上升了28.22%、34.86%、61.01%、40.56%（P＜0.05），表明模型组小鼠小肠屏障的完整性受到破坏，可能与ROS攻击肠道上皮组织结构，使肠屏障受损有关。与模型组相比，阳性对照组血清中D-LA、DAO、LPS、iFABP水平分别下降了23.08%、24.00%、32.16%、23.35%（P＜0.05），均恢复至正常组水平；桑叶生物碱低、中、高剂量组血清中D-LA浓度分别降低了9.82%、17.04%、22.14%（P＜0.05），DAO活力分别降低了13.59%、15.66%、23.22%（P＜0.05），LPS含量分别降低了14.64%、19.95%、32.12%（P＜0.05），iFABP质量浓度分别降低了4.18%（P＞0.05）、13.29%（P＜0.05）、19.98%（P＜0.05），其中桑叶生物碱高剂量组中D-LA、DAO、LPS水平与阳性对照组、正常组相比无显著差异（P＞0.05），iFABP水平与阳性对照组相比无显著差异（P＞0.05），但与正常组相比差异显著（P＜0.05）。上述结果表明，实验剂量范围内的桑叶生物碱能够显著降低血清中D-LA、DAO、LPS、iFABP水平，有利于小肠屏障完整性和通透性的改善，其中高剂量的桑叶生物碱能使血清中D-LA、DAO、LPS恢复到正常水平，但在实验剂量和时间范围内还不能使iFABP恢复至正常水平。

2.4 桑叶生物碱对实验小鼠小肠组织形态学的影响

HE染色法是对组织进行病理学观察的可靠手段之一。本研究通过HE染色技术观察正常和病变小肠组织的一般形态结构，以探究桑叶生物碱对模型鼠肠道屏障的改善作用。各组小鼠小肠组织切片的HE染色结果如图3所示。

图3 桑叶生物碱对实验小鼠小肠组织病理学的影响（×200）Fig. 3 Effect of mulberry leaf alkaloids on intestinal histopathology in mice (× 200)

如图3所示，正常组小鼠小肠组织的病理学表现正常，组织结构完整，上皮细胞排列紧密，黏膜层未见明显损伤。与正常组相比，模型组小鼠小肠组织细胞大量破碎，发生凋亡、坏死，排列紊乱，细胞间紧密连接结构被破坏。经GSH和桑叶生物碱干预后，小肠上皮结构损伤的程度逐渐减轻，其中以阳性对照组和桑叶生物碱高剂量组改善效果最好。与模型组相比，阳性对照组和桑叶生物碱高剂量组中小肠细胞形态正常，排列整齐规则，上皮结构完整，边界清晰。表明桑叶生物碱可能通过改善细胞凋亡恢复小肠上皮组织结构的完整性，有效保护肠道屏障的完整。

2.5 桑叶生物碱对实验小鼠小肠组织中ZO-1、Occludin、Claudin-1 mRNA表达水平的影响

紧密连接蛋白在维持肠屏障完整性中起着重要的作用，控制着肠屏障的通透性，由跨膜蛋白Claudins、Occludin和外周膜蛋白ZOs组成[25]。Occludin是第一个被确定的紧密连接跨膜蛋白，定位于紧密连接处，可以通过细胞膜外的部分与相邻细胞结合而产生细胞旁封闭，有助于控制细胞间的通透性[26]。Claudin-1能够限制离子进入上皮细胞，并与邻近细胞中的其他连接蛋白相互作用，形成避免脂质和蛋白质扩散的围栏，调节紧密连接复合体的通透性[27]。ZO-1主要位于相邻上皮细胞的边界处，充当着细胞内支架蛋白，将Occludin、Claudin-1锚定到细胞骨架，协同控制肠屏障的通透性[28]。桑叶生物碱对小鼠小肠组织中ZO-1、Occludin、Claudin-1mRNA表达水平的影响如图4所示。

图4 桑叶生物碱对小鼠小肠组织中ZO-1（A）、Occludin（B）、Claudin-1（C）mRNA表达水平的影响Fig. 4 Effect of mulberry leaf alkaloids on mRNA expression levels of ZO-1 (A), occludin (B) and claudin-1 (C) in intestinal tissue of mice

如图4所示，与正常组相比，模型组小鼠小肠组织中ZO-1、Occludin、Claudin-1mRNA表达水平显著下降了66.01%、73.44%、51.71%（P＜0.05），表明模型组小鼠肠屏障结构中紧密连接相关蛋白的基因表达水平显著下降。桑叶生物碱干预后，随着灌胃剂量的增加，ZO-1、Occludin、Claudin-1mRNA表达水平呈现递增的趋势。与模型组相比，阳性对照组中ZO-1、Occludin、Claudin-1mRNA表达水平分别显著上升了171.61%、198.71%、100.53%（P＜0.05），均能恢复至正常组或者接近正常组水平。与模型组相比，桑叶生物碱低、中、高剂量组中ZO-1mRNA表达量分别显著上升了59.47%、132.10%、154.67%（P＜0.05），OccludinmRNA表达分别增加了21.80%（P＞0.05）、133.02%（P＜0.05）、272.78%（P＜0.05），Claudin-1mRNA表达量分别增加了8.79%（P＞0.05）、45.62%（P＜0.05）、81.16%（P＜0.05）。其中桑叶生物碱高剂量组中ZO-1mRNA表达量与阳性对照相比无显著差异（P＞0.05），但与正常组相比差异显著（P＜0.05），Occludin、Claudin-1mRNA表达量与正常组相比无显著差异（P＞0.05）。结果表明，桑叶生物碱能够通过调节模型组小鼠小肠ZO-1、Occludin和Claudin-1mRNA表达水平来恢复细胞间的连接结构，修复肠道屏障的结构损伤。在实验时间和剂量范围内，高剂量的桑叶生物碱仅能将Occludin、Claudin-1mRNA表达量恢复至正常水平。

2.6 ZO-1、Occludin、Claudin-1 mRNA表达水平和D-LA、DAO、LPS、iFBAP水平的相关性分析结果

据报道，ZO-1、Occludin和Claudin-1的表达量下降时，细胞间紧密连接被破坏，通透性增加，肠道内大分子物质自由进出肠道，血液中相应物质的含量升高[29]。对ZO-1、Occludin、Claudin-1mRNA表达水平和D-LA、DAO、LPS、iFBAP水平的Pearson相关性分析，结果如表4所示。

表4 ZO-1、Occludin、Claudin-1mRNA表达量与D-LA、DAO、LPS、iFBAP水平的相关性分析结果Table 4 Correlation analysis between mRNA expression levels of ZO-1, occludin and claudin-1 and D-LA, DAO, LPS and iFBAP levels

如表4所示，ZO-1、Occludin、Claudin-1mRNA表达水平与D-LA、DAO、LPS、iFBAP水平呈显著负相关，相关系数的绝对值在0.6～0.8之间，表明两个变量之间呈现中度相关。结合以上结果可初步得出结论，ZO-1、Occludin、Claudin-1mRNA表达量的下降，会促进D-LA、DAO、LPS、iFBAP进入血液，导致其在血清中含量升高。桑叶生物碱可通过上调ZO-1、Occludin、Claudin-1mRNA表达水平，提高细胞间紧密连接性，从而恢复肠道上皮屏障的完整性和通透性，进而阻止肠道中的分子物质进入血液循环。

3 讨 论

D-Gal是一种还原糖，在正常浓度下会代谢为葡萄糖，但是D-Gal含量过高时，可在半乳糖氧化酶的催化下转化为醛糖和氢过氧化物，导致ROS的大量产生，诱导氧化应激反应[30]。ROS是导致细胞损伤、死亡的重要物质，可诱导器官组织发生氧化损伤。因此，动物实验中常通过连续注射D-Gal建立慢性损伤模型[14]。肠道屏障作为肠道抵御外界刺激最重要的一道防线，是由完整的肠上皮细胞和相邻细胞间的紧密连接及黏液层构成，也称作肠黏膜上皮屏障[31]。由于肠道是食物消化吸收的主要场所，肠道黏膜长期暴露在膳食脂肪和蛋白质氧化产物的促氧化作用下，可能会扰乱肠道的氧化还原状态，导致氧化应激的发生[32]。作为破坏肠屏障的重要起始作用物质，ROS在肠道损伤早期起着至关重要的作用。ROS可通过氧化脂质和关键氨基酸，引起细胞基本结构被破坏，导致上皮组织的完整性丧失，通透性增加[33]。鲍伟光[34]、邹轶[35]等的研究均显示氧化应激条件下肠道绒毛断裂，上皮细胞的基本结构遭受了严重损害。在大多数研究中通常使用一些血液指标来指示肠道完整性和通透性，以评估肠屏障受损的程度。这些指标包括D-LA、DAO、LPS、iFABP水平[36]。正常情况下，血液中D-LA、DAO、LPS和iFABP的水平很低。当肠屏障结构被破坏，这些物质会通过受损的组织进入血液，所以通过测定血液中相应物质的含量可判断肠道损伤的情况。根据珠娜等[37]的研究显示，辐射产生的大量ROS会攻击小鼠肠上皮结构，导致肠绒毛萎缩、断裂，细胞变性坏死，血清中D-LA、LPS水平及DAO活力显著升高，并且其水平与肠道氧化损伤的程度成正比。本研究中，模型鼠血清中D-LA、LPS、iFABP水平和DAO活力较正常组显著升高，提示在D-Gal诱导下，小肠屏障结构可能发生了损伤。灌胃桑叶生物碱和阳性药物GSH后，可显著降低模型鼠血清中相关指标的含量，以高剂量的桑叶生物碱作用效果最好。表明桑叶生物碱可有效修复肠黏膜上皮结构损伤。吴国泰[38]的研究中显示，甘青乌头的总生物碱能够上调肠炎大鼠回肠组织中DAO活力，从而降低血清中DAO活力，有效修复肠屏障损伤。为了更加直观地观察桑叶生物碱对肠道屏障损伤的改善效果，对实验小鼠的小肠组织切片进行了病理学观察。结果显示，桑叶生物碱可有效改善模型鼠中肠细胞坏死、破碎、排列紊乱的现象，恢复细胞间的紧密连接结构。这与蒋晓梅等[39]的研究结果相似，该研究证实黄连总生物碱能够降低结肠炎大鼠肠黏膜损伤，促进肠细胞增长，改善肠屏障功能障碍。

ROS破坏肠道屏障的一种重要机制是通过直接或间接改变紧密连接蛋白的分布和表达[14]。肠上皮屏障中，紧密连接蛋白以Occludin、Claudins和ZO-1等组成的多聚体复合物存在，具有选择渗透性，通过细胞旁途径调节离子、溶质和水进出肠道，而阻止有毒大分子或有害物质通过，对维持肠道屏障完整性和通透性至关重要[40]。袁敏兰等[41]研究表明持续的氧化应激造成肠屏障结构被破坏，肠组织的通透性增加，表现为肠道切片中细胞完整性丧失、排列紊乱，Claudin-1、Occludin和ZO-1的mRNA表达水平显著下降。本研究中，与正常组相比，模型组小鼠小肠组织中ZO-1、Occludin、Claudin-1mRNA表达水平均显著下降，灌胃GSH和桑叶生物碱后，三者的表达量均显著上升，其中高剂量的桑叶生物碱能将Occludin、Claudin-1mRNA表达量恢复至正常组水平。Pearson相关性分析结果表明，D-LA、DAO、LPS、iFABP水平与ZO-1、Occludin、Claudin-1mRNA表达水平呈现出显著负相关。研究表明，桑叶生物碱可能通过上调ZO-1、Occludin、Claudin-1mRNA表达水平，恢复细胞间的紧密连接结构，改善肠道屏障的完整性和通透性，从而阻止肠腔内物质进入血液循环中。其他生物碱也有相似的调节作用，Yu Xiuting等[42]发现，向模型鼠灌胃小檗碱可显著提高其结肠ZO-1、ZO-2、Claudin-1、Occludin等的蛋白表达水平，有效改善结肠黏膜屏障损伤，恢复其完整性。

综上所述，不同剂量的桑叶生物碱可显著降低模型小鼠血清中D-LA、LPS、iFABP水平及DAO活力，改善肠上皮细胞凋亡、排列紊乱的现象，其机制可能与其显著上调ZO-1、Occludin、Claudin-1mRNA表达水平，改善肠细胞凋亡、坏死，恢复细胞间的紧密连接结构有关。本项研究结果有助于小肠屏障损伤的预防和治疗，也为桑叶生物碱的开发利用提供了理论依据。