山西中部4型禽腺病毒遗传进化及其分离毒株致病性分析

刘 璐，王 晨，张 丹，高 宇，程 宇，谭世明，梁立滨，马海利

（山西农业大学 动物医学学院，山西 太谷 030801）

禽心包积水-包涵体肝炎综合征（Hydropericardium syndrome-inclusion body hepatitis，HPS-IBH）是一种主要由4型禽腺病毒（Fowl Adenovirus-4，FAd V-4）引起的高度传染性和高死亡率的新型家禽疾病[1]。2013年，HPS-IBH开始在我国部分地区流行，2015年在河南、山东、山西、江苏、安徽等省份暴发并传入其他省份[2]。该病多发于4~10周龄的鸡，感病鸡通常无明显症状而突然死亡，死亡率为10%[3]；剖检死鸡可见肝脏肿胀，质地脆弱易破裂，呈点状或斑点状出血，并有土黄色坏死灶，心包积水严重[4]。

禽腺病毒可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ群，FAdV-4属于禽腺病毒Ⅰ群[5]。Hexon蛋白是禽腺病毒的主要抗原蛋白，具有型、型间、组特异性抗原表位和中和性抗原表位，可与抗体结合，是禽腺病毒的典型结构蛋白[6]，对诊断和预防Ⅰ群禽腺病毒感染有重要意义[7-9]。FAdV-4有2个Fiber蛋白，即Fiber-1和Fiber-2，其中Fiber-2蛋白比Fiber-1蛋白免疫活性更高[10]。Fiber-2蛋白的羧基端头部区域是特异性受体的结合位点，是病毒早期吸附宿主细胞的必需位点，具有抗原性，可用于研制表位疫苗[11]。

目前，关于山西禽腺病毒4型的研究，仅见陆冰洋等[12]对山西省某养鸡场4型禽腺病毒研究。本研究对山西中部地区的太谷、祁县、介休、临汾、长治、交城、柳林等养鸡场11份疑似心包积水-肝炎综合征病鸡的肝脏进行了FAd V-4的PCR检测，并对阳性样品进行了Hexon蛋白和Fiber-2蛋白全基因序列扩增、测序和分析，用鸡肝癌细胞（LMH）对阳性样品进行了FAd V-4病毒分离，研究病毒对SPF鸡胚和SPF鸡的致病性，旨在为山西省FAd V-4感染防控提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

于2020年采集山西中部地区的太谷、祁县、介休、临汾、长治、交城、柳林等养鸡场11份疑似心包积水-肝炎综合征病鸡的肝脏组织样品，-20℃保存备用；LMH保存于山西农业大学兽医传染病实验室；TIANamp Genomic DNA Kit DNA提取试剂盒购自哈尔滨世纪元亨生物药业有限公司。

1.2 引物设计与合成

根据Gen Bank中发表的Ⅰ群禽腺病毒代表毒株FAdV-4 GC株（登录号：EU177544.1），使用Primer Premier 5.0软件设计用于FAd V-4阳性病料的检测引物和扩增FAd V-4的Hexon、Fiber-2基因全长的引物（表1）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 引物信息Tab.1 Primer information

1.3 病毒DNA提取

取样品组织，按1∶2比例加PBS匀浆，反复冻融3次，5 000 r/min离心30 min，上清用0.22μm滤器过滤，参照TIANamp Genomic DNA Kit说明书提取样品病毒DNA，-80℃保存备用。

1.4 病料PCR鉴定

以提取的病毒DNA为模板，用FAd V-4的检测引物进行PCR扩增[13]，扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳30 min，检测目的条带。

1.5 FAdV-4 Hexon和Fiber-2全基因扩增、克隆及测序

以阳性样品的DNA为模板（阴性对照以无菌去离子水代替DNA模板）进行Hexon和Fiber-2全基因序列扩增。取5μL PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，将PCR阳性产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.6 FAdV-4 Hexon与Fiber-2基因序列分析

采用DNAStar Version 7.1软件中的MegAlign程序对测序结果进行比对，并与GenBank中获得的Ⅰ群FAd V的27个血清型参考序列进行同源性比较，用MEGA 7.0软件进行遗传进化分析并且绘制遗传进化树。FAdV-4参考序列如表2所示。

1.7 病毒分离培养

将PCR阳性样品进行处理，取上清液100μL接种LMH细胞，每天观察细胞病变（CPE），待病毒液形成稳定的细胞病变后继续传5代，收集病毒液进行PCR检测[14]。

1.8 病毒的TCID50测定

将生长良好的LMH细胞消化后，加入96孔板中（100µL/孔）。将病毒液进行10倍梯度稀释（10-8~10-1）后接种于96孔板中（100µL/孔），每个稀释梯度8个平行，设正常细胞为对照孔，37℃下置于二氧化碳培养箱中连续观察5~7 d，并记录细胞病变结果[15]，按照Reed-Muench法计算TCID50[16]。

1.9 鸡胚致病性试验

取发育良好7 d的SPF鸡胚7枚，其中，5枚接种F5病毒，接种量为0.2 mL/枚，2枚接种等量无菌生理盐水作为对照组。用蜡封口后置于37℃孵化箱培养，每隔6 h查看鸡胚一次，将24 h内死亡的鸡胚弃去，120 h后收取鸡胚。取鸡胚肝脏、心脏、大脑组织进行PCR检测。

1.10 SPF鸡致病性试验

将7只3周龄的SPF鸡随机分成2组，其中，攻毒组5只，肌肉注射攻毒剂量为105.74TCID50/0.1 mL，0.2 mL/羽；对照组2只，肌肉注射相同剂量的无菌PBS溶液。相同条件下隔离饲养，每12 h观察一次，连续观察15 d，统计鸡的发病和死亡情况。病毒接种后第3、7、14、21、28天采集泄殖腔棉拭子，检测攻毒鸡的排毒情况。剖检病死鸡，观察剖检病理变化。采集病死鸡的脑、脾脏、肾脏、胸腺、睾丸、肠、肺、法氏囊、胸肌、肝脏和心脏进行FAd V-4的PCR检测。

2 结果与分析

2.1 病料样品的PCR检测结果

疑似病料样品用Hexon基因检测引物进行扩增，电泳结果显示（图1），11份样品在约421 bp处均出现目的条带，与预期大小一致，初步判断这11份病料均为FAdV-4阳性样品。对上述11份阳性病料的基因扩增产物进行电泳，结果显示，Hexon基因在约2 840 bp处有条带（图2），Fiber-2基因在约1 440 bp处有条带（图3）。

2.2 FAdV-4 Hexon与Fiber-2全基因核苷酸序列的同源性分析

对测序得到的11份样品中FAdV-4的Hexon和Fiber-2基因序列进行比对分析，发现11份样品FAd V-4的Hexon和Fiber-2基因序列同源性为100%，可认定为同一流行毒株，其序列已上传至NCBI（序列号：MZ365043，MZ436002）。与Gen Bank中FAd V的参考序列进行同源性比对，结果显示，Hexon基因与参考株的同源性为67.7%~100%，与基因C型的血清4型参考株同源性最高，为98.4%~100%；与基因A、B、E型参考株的同源性次之，分别为75.3%、74.0%、73.2%~74.1%；与基因D型参考株的同源性最低，仅为67.7%~69.6%。Fiber-2基因与参考株的同源性为43.2%~100%，与基因C型的血清4型参考株同源性为95.9%~100%；与基因A、B、E型参考株的同源性分别为74.7%、74.4%、49.5%~49.9%；与基因D型参考株的同源性最低，为47.8%~49.9%。分析表明，分离毒株为基因C型的血清4型FAd V，命名为SX2020（2020年分离自山西省）。

SX2020株Hexon基因序列与国内外4型参考株Hexon基因序列的同源性为98.4%~100%，其中与安徽株、广东株、山东株、河南株的同源性为100%；与朝鲜株的同源性最高为99.8%；与俄罗斯株的同源性为98.9%；与印度株的同源性最低，为98.4%~98.5%。SX2020株Fiber-2基因序列与国内外4型参考株Fiber-2基因序列的同源性为95.9%~100%，其中与安徽株、广东株、山东济南株、河南郑州株的同源性为100%；与印度株同源性最高为98.1%；与墨西哥株的同源性为97.3%；与澳大利亚和加拿大株的同源性最低，为95.9%。

2.3 FAdV-4 Hexon与Fiber-2全基因推导氨基酸序列同源性分析

SX2020株与参考株之间Hexon全基因推导氨基酸序列的同源性为73.2%~99.3%，与基因C型的血清4型参考株的同源性最高，其中与安徽株、广东株、山东株、河南株的同源性均为99.3%；与印度株同源性最高，为98.8%~99.0%；与俄罗斯株的同源性次之，为98.2%；与朝鲜株的同源性最低，为97.3%~97.4%。SX2020株与参考株之间Fiber-2全基因推导氨基酸序列的同源性为6.0%~99.6%，与基因C型的血清4型参考株的同源性最高，其中与山东株、广东株、安徽株的同源性均为99.6%；与澳大利亚株、印度株、墨西哥株的同源性为93.7%~97.3%。

通过与国内外4型参考毒株Hexon和Fiber-2氨基酸同源性分析发现，SX2020株与国内参考株氨基酸序列的同源性在99%以上，而与国外参考株相比存在多处氨基酸的替换。

2.4 FAdV-4 Hexon与Fiber-2基因的遗传进化关系

从FAd V-4 Hexon和Fiber-2基因进化树可以看出（图4、5），SX2020株与基因A、B、D、E型参考毒株位于不同分支上，遗传距离相对较远；与基因C型的参考毒株均位于同一个分支上；而与4型毒株位于一个小分支上，遗传距离较近，说明SX2020株属于基因C型的FAd V-4。另外，SX2020株与国内株同源性较近，位于同一个分支上；与国外株距离较远，同源性远近关系依次为印度株、俄罗斯株和朝鲜株。

2.5 病毒分离培养结果

将处理的FAdV-4阳性样品上清液接种LMH细胞，在第1代即可观察到CPE。随着传代次数的增加，特征性CPE稳定出现，LMH细胞变大变圆，部分单个细胞分散，有的4、5个细胞聚成小团，细胞间隙增大，最终致细胞崩解，对照组细胞均无病变。分别取1~5代细胞培养物，提取病毒DNA进行FAdV Hexon基因的PCR检测，结果发现，1~5代均扩增出目的基因片段，说明成功培养出FAdV-4病毒。

2.6 病毒TCID50测定结果

将第5代病毒进行10倍连续稀释并接种于96孔板，置于37℃二氧化碳培养箱内培养，记录细胞病变情况，按照Reed-Muench法计算TCID50，结果显示，分离毒株病毒滴度为105.74TCID50/0.1 mL。

2.7 鸡胚致病性试验结果

将第5代病毒接种7 d SPF鸡胚后，收胚时未发现死胚，攻毒组感染鸡胚后，胚胎体表潮红，全身有出血点，胚体缩小，剖检死胚可见肝脏肿大，呈土黄色，质脆易碎；对照组鸡胚未见异常（图6）。

提取病鸡胚的肝脏、心脏和大脑组织的DNA，用Hexon引物进行PCR扩增，扩增产物经电泳检测后可见肝脏和心脏出现明显的特异性目的条带，与预期片段大小（421 bp）一致；但在大脑组织中未扩增出目的条带，说明SX2020病毒可存在于鸡胚肝脏与心脏中，但并未通过血脑屏障。

2.8 SPF鸡致病性试验结果

攻毒组SPF鸡接种细胞毒后，第3天有2只雏鸡表现出食欲不振、精神萎靡、羽毛蓬乱、呼吸困难、排绿色稀粪，其中一只于第6天病死，另一只雏鸡逐渐耐过；对照组雏鸡无死亡现象。攻毒SPF鸡的发病率为40%（2/5），病死率为50%（1/2）；病死鸡剖检可见心包腔中有淡黄色清亮的积液，肝脏肿胀且有坏死点（图7）。

对病死鸡的脑、脾脏、肾脏、胸腺、睾丸、肠、肺脏、法氏囊、胸肌、肝脏和心脏组织进行PCR检测，均可扩增出421 bp的目的片段，说明SX2020病毒可广泛分布于感染鸡的各个脏器内。

检测病毒接种后第3、7、14、21天鸡的泄殖腔棉拭子，结果显示，攻毒组鸡PCR检测均为阳性，对照组鸡均为阴性；检测第28天的泄殖腔棉拭子，攻毒组与对照组PCR检测均为阴性，表明SX2020病毒感染雏鸡后排毒时间可持续21~28 d。

3 结论与讨论

禽腺病毒病是近年来影响世界养禽业的重要传染病之一。FAdV可引起产蛋量下降、包涵体肝炎及心包积液综合征，其已成为国内外研究的焦点。冯敬敬等[17]于2015—2020年从京、津、冀、鲁等30多个省份收集到7 098份FAdV疑似样品，成功测序Hexon基因1 668份，检测出了FAd V-1型、FAd V-2型、FAd V-3型、FAd V-4型、FAdV-5型、FAd V-6型、FAd V-7型、FAdV-8a型、FAd V-8b型、FAdV-9型、FAd V-10型和FAd V-11型，其中，FAd V-4型占比最高，达38.25%，说明FAdV在我国分布广泛。

由于FAd V的血清型众多，不同血清型致病性不同。因此，对FAd V血清型鉴定及致病性的研究尤为重要。Hexon蛋白是FAdV的主要结构蛋白，通过对Hexon基因进行测序和遗传进化比对，可准确区分不同的血清型，常作为FAdV基因分型的靶基因[18]。本研究分离的SX2020株为基因C型的血清4型FAdV，其Hexon和Fiber-2全基因推导氨基酸序列与国内FAd V-4参考株的同源性在99%以上，与国外FAd V-4参考株的同源性为98.4%~98.5%，说明Hexon与Fiber-2蛋白保守性极强。宋玲玲等[19]研究证实，山东株Hexon基因与国内参考株Hexon基因序列相同，具有高度保守性。金前跃等[20]研究表明，河南株FAd V-4 ZZ株的Hexon基因与国内流行的CH/JSXZ/2015和SDSX1株的核苷酸序列同源性均为100%，与国外株同源性分别为98.69%和98.90%，即与国内株同源性一致，与国外株则存在遗传变异，此结论与本研究得出的结论一致。RASHID等[21]对广西9个暴发FAdV疫情地区中分离毒进行了全基因组测序，结果表明，分离株与其他最近分离的中国株亲缘关系较近，主要结构基因序列与非中国分离株相比有一些缺失和明显的氨基酸突变。

任士飞等[22]从江苏某地分离的FAdV-4对3周龄SPF雏鸡的致死率为100%，死亡鸡可见典型的心包积液与包涵体肝炎症状。程增青等[23]从河南分离的FAd V-4毒株感染SPF鸡后，于感染后第2天开始发病，死亡期主要集中在感染后第3~7天，感染后第10天未死亡鸡均恢复正常。YIN等[24]从120日龄产蛋鸡肝脏样品中分离出高致病性禽腺病毒（FAdV）毒株AH-F19，可引起3周龄SPF鸡全部死亡，并表现出典型的心包积液和肝炎。本研究采用分离培养的SX2020毒株接种7日龄鸡胚，可使鸡胚发生病变；接种3周龄SPF雏鸡，可使雏鸡发病死亡，发病率为40%，病死率为50%，说明SX2020毒株具有较强的致病性；病毒接种后第3~21天泄殖腔棉拭子PCR检测呈阳性，第28天检测呈阴性，表明SX2020毒株感染雏鸡后排毒时间可持续21~28 d。

本研究对采自山西中部地区的太谷、祁县、介休、临汾、长治、交城、柳林等养鸡场的疑似FAd V-4病料进行了PCR检测，并分离出1株FAd V-4病毒，其Hexon基因序列与国内同源性较高可达99%以上；接种SPF鸡胚与SPF鸡后均表现出一定的致病性；攻毒鸡的排毒时间长，可达21~28 d。该研究结果为山西省FAdV-4疫苗的研发及防控提供了试验依据。