不同文件中多项回归分析线性验证异同分析

朱岭峰， 吴海洋， 章雪瑜， 朱宇清

（1.深圳昭蓝检测实验室，广东 深圳 518000；2.上海科华生物工程股份有限公司，上海 200233；3.上海市临床检验中心，上海 200126）

2019年，中国合格评定国家认可委员会（China National Accreditation Service for Conformity Assessment，CNAS）发布了CNASGL037《临床化学定量检验程序性能验证指南》，推荐采用多项回归分析来验证线性区间。而最为医学实验室所熟知的多项回归分析验证线性区间的文件分别为WS/T 408-2012《临床化学设备线性评价指南》（简称WS/T 408—2012）和美国临床实验室标准化学会（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）2003年发布的 EP06-A文件，2个文件要求的线性区间验证的实验设计、样本制备与测定等具体操作步骤没有明显差别。但当实验数据呈现非线性关系时，对于临床可接受允许偏差的计算方式完全不同，WS/T 408—2012要求评估整个稀释范围的非线性程度，CLSI EP06-A文件要求评估每个稀释浓度的非线性程度。

WS/T 408—2012介绍的方法由KROLL等[1]提出，并在美国病理学家协会（the College of American Pathologists，CAP）的校准验证和线性评估（calibration verification and linearity program，CVL）中使用多年；CLSI EP06-A文件在CLSI EP06-P文件和CAP线性评价的基础上，经过不断实践和经验总结，被认为是目前最好的线性评价方法[2]。但无论是WS/T 408—2012，还是EP06-A文件，在医学实验室实际使用的过程中均仍然存在一些问题。本文以验证雌二醇（estradiol，E2）项目的线性范围为例进行分析。

收集足量高值（H）、低值（L）2份标本，按L、0.8L+0.2H、0.6L+0.4H、0.4L+0.6H、0.2L+0.8H、H配制成6个不同浓度的系列样品，每个样品在某化学发光仪上随机测定3次，在1 d内完成。结果记录见表1。

表1 E2实验结果

首先确定实验方法可接受的不精密度、线性偏差或非线性程度的允许误差范围，该项目的线性偏差均设定为1/3 允许总误差（allowable total error，TEa）。目测有无明显离群值，如有，查找原因并解决。

采用多项式回归分析，计算不精密度（WS/T 408—2012与CLSI EP06-A文件中关于验证精密度的内容不同，但本研究不做讨论），符合要求后，将测定数据分别拟合一次多项式（b0+b1X）、二次多项式（b0+b1X+b2X2）和三次多项式（b0+b1X+b2X2+b3X3），根据t值判断拟合曲线的非线性系数（b2和b3）与0的差异是否有统计学意义，如有，则判断为非线性；无，则为线性。当存在非线性时，以回归分析标准误最小者为最适多项式。

当初步判断为非线性时，按WS/T 408—2012要求计算最优拟合曲线与直线的平均差异值（average deviation from linearity，ADL），计算公式为：

式中P（x）为最适多项式在每个稀释浓度处的估计值，b0+b1X为拟合线性（直线）模型在每个浓度处的估计值，n为样本数与测定次数的乘积，为所有测定浓度测量数据的平均值。ADL应小于查表获得的ADL临界值，否则判断为临床不可接受的非线性。统计结果见表2、表3、图1。

表2 多项回归分析结果

表3 非线性程度判断（WS/T408—2012）

图1 E2多项回归线性拟合图

当初步判断为非线性时，按CLSI EP06-A文件要求计算线性偏差，计算公式为：DLi=P（x）-（b0+b1x），式中P（x）为最适多项式在每个稀释浓度处的估计值，b0+b1X为拟合线性（直线）模型在每个浓度处的估计值。每个点DLi均应小于设定误差，否则判断为临床不可接受的非线性。如需要换算成百分比，则将每DLi÷该浓度的测量均值，再×100%。统计结果见表4、图1。

表4 非线性程度判断（CLSI EP06-A文件）

可以看到，按照不同的文件要求计算同一实验数据，得到的结论截然相反。为了得到更为直观的结论，可以按照平均斜率法和逐步直线回归统计法[3]处理数据。统计结果见表5、图2。

图2 E2平均斜率法回归图

表5 平均斜率法和逐步直线回归统计结果

通过逐步直线回归统计可以发现，从第4个点开始斜率已经不符合平均斜率法的要求（b1=1±0.03），所以判断该范围内呈非线性。按WS/T 408—2012的方法，该项为临床可接受的非线性；而按CLSI EP06-A文件的方法，则为临床不可接受的非线性。但是通过平均斜率法进行直观的判断，可以发现该项目为非线性。

尽管WS/T408—2012也提到参考CLSI EP06-A文件，采用了多项式法进行线性评价，但对非统计学线性的情况进行临床线性的评估则是采用KROLL等[1]提出的最优拟合曲线与直线的平均差异值，即ADL。从ADL计算公式中可以发现，其反映的是最优拟合曲线与直线离散程度，因为该公式的模型就是标准差公式的模型，所以WS/T408—2012评估的是全部稀释范围的非线性程度，个别稀释浓度点的非线性由于计算ADL而被忽略了[4]，这一方案也被CAP运用于其线性评估和校准验证的调查。

CLSI EP06-A文件的线性评价方法也存在不足：（1）计算线性偏差时是采用最适多项式与直线回归（并非测量均值）估计值的差值来表达，但是偏差的目标并未明确，仅要求实验室必须确定自己的测量误差目标；（2）直线回归对于呈曲线表示的数据时，降低了斜率，又增加了截距，往往使低浓度的数据点常处在回归直线之下，直线回归线上的估计值明显偏高，导致有些数据点的最适多项式与直线回归估计值的差异过高，得出非线性的结论。

在CAP的介绍中可发现，目前的CVL的调查相较于WS/T408—2012有了较大的变化：（1）修改了偏差的目标；（2）增加了各个稀释点的非线性的判断。在方法评估中，公认的做法是指定TEa，并按比例分配总误差用于偏差的目标，通常，在CVL调查中，1/2TEa用于校准验证，1/4TEa用于线性评估[5]。同时，在计算ADL的基础上，增加了对每个检测值与最适直线回归的差值计算，并且要求差值＜1/4TEa。

综上所述，合适的线性范围既可以反映该范围内检测结果真实的比例关系，也可避免不必要的稀释操作，是仅次于精密度的重要指标。临床实验室应认识到实验室数据是第1位的，任何统计方法都可能因存在缺陷而产生错误的结论。临床实验室质量管理职能部门除组织常规的能力验证活动外，也可以尝试提供线性验证和校准验证的调查，以便更全面地反映实验室各检测系统的检测水平，提高检测质量，更好地为临床诊断服务。