核心参数模型在食品微生物监控中的研究进展

沈雨婷，栗绍文，孟宪荣

（华中农业大学动物医学院，湖北 武汉 430070）

WHO估算每年将近6亿人因食用被污染的食品而生病，造成约42万人死亡，其中，引起食品污染的主要微生物是弯曲菌（Campylobacter）、沙门菌（Salmonella）和肠出血性大肠埃希菌（EnterohaemorrhagicEscherichia coli, EHEC）等致病菌[1]。食源性疾病的暴发促使研究人员寻找更快捷有效的方法来监控食品中的微生物。随着计算机技术的发展，ROBERTS等[2]提出“预测微生物学”这一概念，通过开发相应的数学模型可预测食品从原材料到食用过程中每个阶段微生物的行为，解决食源性疾病暴发下检测手段不足的问题。构建正确的预测模型可为食品安全决策者提供准确且快速的微生物信息，有效地开展微生物定量风险评估[3]、货架期估算[4]等生产活动。

现在主要的分类方式由WHITING等[5]建立，按照变量类别分为一级模型、二级模型和三级模型。二级模型则是描述微生物生长参数（最大生长速率μmax、延滞时间λ）与环境参数（温度、pH等）之间的关系。现在研究过程中使用较多的二级模型是平方根模型[6−7]，其仅考虑为温度这一环境变量。为了面对更为复杂多样的食品环境，如核心参数模型（cardinal parameters model，CPM）[8]和响应面模型（response surface model）[9]等定量描述多环境因素对生长参数影响的模型将会被更广泛地应用到研究和实践中。核心参数模型的优点是其容易获得参数的初始值且参数具有明确生物学意义、类型广泛，因而逐渐成为研究预测微生物学的重要工具[10−12]。

本文首先介绍了核心参数模型的概念以及现阶段国内外使用最广的核心参数模型。然后介绍了核心参数模型的扩展和优化情况以及其在食品安全领域的应用，最后对未来的研究方向进行了展望，以期为预测微生物学的相关研究提供参考。

1 核心参数模型

核心参数模型是预测微生物模型中的一种二级模型，最早由ROSSO等[8]提出基于温度的CPM（cardinal temperature model with inflection, CTMI），通过定义核心环境因素即温度的参数（最大值、最小值和最适值）和最适条件时的最大生长速率来描述微生物生长速率和温度的方程。随后又提出了基于pH的CPM（cardinal pH model）[13]和基于水分活度（water activity，aw）的CPM[14]。ROSSO等[8]所建立的CPM相对于现在使用最频繁的平方根模型的优点在于其参数具有明确的生物学意义，并且随着研究的深入开发了针对不同环境因素的模型，大大增强了适用范围，成为研究食品生产、贮藏过程中微生物监控技术的重要工具。

1.1 单因素的核心参数模型

Gamma概念（γconcept）[15−16]量化了环境因素对微生物生长速率的独立影响，CPM则基于Gamma概念进一步发展，其中每个最佳生长条件的μmax（μopt）因与最佳生长条件不同的每个环境因素而降低。每个次优环境因子的影响γ（X）都用一个介于0和1之间值的项来表示；当环境因素值在Xmin—Xmax的范围之外时，γ（X）为0。

单因素的CPM公式[16]为：

式中，μmax为最大生长速率，lnCFU·（g·h）−1；μopt是最佳生长条件下的最大生长速率，lnCFU·（g·h）−1；γ（X）描述了环境因素X对微生物生长速率的相对影响。

γ（X）的类别多样。现阶段使用较多的描述温度、pH、aw的γ（X）公式具备拐点[17]（如式2）。

描述CO2的γ（[CO2]）较为简单[17−18]，公式为：

式中，Xmax、Xmin、Xopt分别是微生物能够生长的最大环境因素值、最小环境因素值以及最适环境因素值；n是形状参数（温度和aw的n为2；pH的n为1）。aw的Xmax一般设定为1；对真菌而言，当不存在CO2时真菌生长最佳，因此，CO2opt可以设置为0%[19]。

常用的平方根模型和Arrhenius模型[20−21]无法准确描述当温度超过Topt时μmax降低这一现象；而从式（2）可以看出，CTMI并非单纯地描述线性关系，其通过计算μopt和Topt，避免了因线性形式所产生的参数间结构相关性等问题，有效增大了模型预测温度的有效范围[8,22]。

描述有机酸的γ（[HA]）则有所不同[23]，其抑制作用主要归因于其未解离形式HA，未解离的酸能够穿透细胞膜，降低细胞内pH从而引起抑制作用。γ（[HA]）的公式如下：

式中，[HAU]、[HA]分别为未解离和初始有机酸的浓度（mmol/L）；MICUHA是未解离有机酸的最小抑菌浓度；pKa为酸解离常数；n1、n2是数学参数，为了最恰当的描述变化，n1被设置为0.5或1.0，n2被设置为1.0或2.0，设置值通过均方误差确定，与有机酸的种类、微生物的类型有一定关系（见表1）[23]。

表1 在不同有机酸中单增李斯特菌和乳酸菌的γ（[HA]）所对应的n1、n2的值[23]Table 1 Values of n1 and n2 corresponding to γ ([HA]) of Listeria monocytogenes and lactic acid bacteria in different organic acids[23]

1.2 多因素的核心参数模型

多因素的CPM基于单因素的CPM，通过将各因素的γ（X）相乘来确定多个环境因素的组合效果。MARC等[24]引入互作效应因子ξ，从每个环境因素项中获得φei，扩展了Gamma概念，以考虑环境因素之间相互作用的影响。例如温度、pH和aw这类环境因素相对独立，互作不明显，ξ可设定为1[19]；而像有机酸的解离会受到温度和pH的影响，需要考虑互作效应[24]。

以基于温度、pH、有机酸的CPM[24]为例，公式如下：

式中，ξ为各因素的互作因子；φei是每个因素对相互作用的影响，根据ψ把生长状态分为三个部分，（i）如果ψ≤阈值（θ），此时微生物生长且各环境因素之间不产生相互作用（ξ=1）；（ii）如果θ<ψ<1，微生物会生长，但由于各因素之间相互作用μmax减小；（iii）如果ψ≥1，微生物不生长（ξ=0），ψ=1为微生物的生长边界。根据理论假设，θ设定为1/2。

2 核心参数模型的扩展及优化

近年来，研究人员对核心参数模型进行扩展和优化，以更加有效地监控食品中的微生物，一是在已有模型的基础上增加新的环境参数，特别是各种有机酸以及有机酸盐等；二是对原有的模型因子进行优化或者扩展。

在原有CPM的基础上增加新的环境参数，可以使模型更加完善，应对复杂的食品环境。GIMÉNEZ等[25]比较已建立的模型，通过合并这些模型获得了描述苯酚、温度、aw、pH、乳酸、亚硝酸盐的核心参数模型。在此之后，研究人员又陆续研究了包括CO2、双乙酸盐等环境因素的γ函数并将其添加到已有的模型上[25−32]，表2简单地展示了与CPM扩展有关的研究。例如通过不断地扩展，MEJLHOLM等建立的模型（2009）[28]包含了12个环境因素及其交互作用，并且通过Ψ值量化生长边界与特定产品特征之间的距离。MEJLHOLM等[29]证实了只要模型的复杂性与产品的复杂性相匹配（即所有重要的环境参数都应包括在模型中），一个预测模型就足以准确预测乳酸杆菌（Lactobacillusspp.）的生长。除此以外，他们还发现尽管新模型并不适用于其它细菌，如肉杆菌（Carnobacteriumspp.）、明串珠菌（Leuconostocspp.）、魏斯菌（Weissellaspp.），但它可以帮助了解关于其他细菌与乳酸杆菌的生长特性的信息，从而提供这些细菌的潜在腐败域[29]。KOUKOU等[32]建立的模型对研究中未涉及的奶制品也有良好的预测。上述扩展以单增李斯特菌等细菌为对象的CPM时所运用的方法可为建立其他微生物的多因素CPM提供有效参考。

表2 核心参数模型在食品环境参数上的扩展Table 2 Extension of the cardinal parameters models on food environmental parameters

微生物的生物学特性各不相同，因而相同环境下它们表现的生长状态也各有差异。例如BAJARD等[33]发现某些李斯特菌菌株的μmax的平方根与温度在次优范围内并不呈线性关系，在10～15 ℃之间存在一变化温度（change temperature），低于此温度时单增李斯特菌的生长速率快于预期。因此，MARC等[24]针对李斯特菌的CTMI进行了调整，在基本温度（Tmin，Topt，Tmax）的基础上增加两个附加参数Tc、T1，获得的aCTMI能更好地预测较低温度下的生长速率（见式12）。同时也有研究证明aCTMI在预测大肠埃希菌K12 MG1655的生长速率优于CTMI和平方根模型[34]。

式中，Tc为变化温度（℃），将模型分为两个部分，在其上下使用不同的数学表达式；T1为第一个线性部分和横坐标直线之间的交点（℃）[24]。

针对pH的CPM展开的改造也非常多样化。有研究表明pH的下降只引起相对较小的生长速度下降，只有当接近极限pH时，生长速率会发生明显下降，而式（2）表示的γ（pH）则接近于对称的抛物线曲线[13]。为了解决这一问题，通过在原有的γ（pH）上进行开方处理（见式13），从而使模型在pHopt周边的变化更趋于和缓；而针对在次优和超优pH范围内pH值变化的反应在结构上存在不同的情况，则进一步将“pH-pHmin”改为“（pH-pHmin）η”（见式14），通过添加参数使得CPM更容易调整到最优状态[35]。

式中，κ、η为数学参数，κ≥1。

除此以外，MEJLHOLM 等[27]建立的模型（2009）仅适用于pH>5.4的环境，而单增李斯特菌在pH<5.4时依然可以生长[36]。为了弥补这一缺陷，MARTINEZRIOS等[37]通过试验和文献数据发现pHmin与温度存在数量关系，因而建立了基于温度的pHmin函数（见式15），并用其代替了原模型中恒定的pHmin，建立了新的CPM。验证结果显示其成功地将适用范围扩展到pH>4.6，从而提高对单增李斯特菌在低pH食品中生长的预测准确性。

式中，TR是与最小的pHmin相对应的温度（℃）；pHminR是TR时的pHmin，T是储存温度（℃）；pHminR、pHminT、pHmin0和pHmin37分别为TR、T、0 ℃和37 ℃时的pHmin。

通过对γ（X）进行优化和修正，CPM能够更准确地预测并监控微生物的生长情况，同时这也对研究人员提出了更高的数学素养要求，需进一步推进学科间的交互。

3 核心参数模型在食品安全领域的应用

预测食品微生物学模型可以量化微生物对食品的理化特性的响应，预测在预期和恶劣的储存条件下的潜在增长，促进微生物食品安全性的评估和管理。核心参数模型通过与其他预测模型联用，尤其是一级模型以及生长概率模型[38−39]，以更好地发挥作用，展现了模型间使用的联动性。

一方面，CPM可以确定主要的环境因素（如温度、pH、aw）对微生物生长的影响，从而开展食品的风险评估以及为食品保存提供参考（见表3）。董庆利等[40]在模型基础上根据食品安全目标（food safety objective，FSO）定性分析生熟食品中单增李斯特菌在不同材质的案板上交叉污染水平并进行风险等级排序，结果表明对案板不进行任何清洗处理时最易引发交叉污染，木质案板相较于塑料和不锈钢的风险更大。BELBAHI等[19]的研究结果显示aw和CO2的组合显著影响了黑曲霉（Aspergillus niger）和链格孢菌（Alternaria alternata）的生长，开发的模型为选择枣类水果保存方式（即冷藏、干燥、改良的大气包装或其组合）提供了决策支持。KAKAGIANNI等[41]模拟食品在交付给消费者之前的运输、分配和储存的各个过程，从而评估在等温和非等温条件下细菌生长情况，用于食品安全的有效风险管理。DALGAARD等[23]则是将CPM和交互模型[42]联用，建立的单增李斯特菌生长和生长边界模型被纳入食品腐败和安全预测软件（food spoilage and safety predictor software，FSSP）以更好地开展实际应用。

表3 核心参数模型在食品风险管理中的应用Table 3 Application of the cardinal parameters models in food risk management

另一方面，CPM还可对食品抑菌剂的效果进行评价，确定合适的抑菌剂使用量，同时也有助于开发新的抑菌剂，例如乙酸、柠檬酸等有机酸已作为食品的抑菌剂被美国食品药品监督管理局（food and drug administration，FDA）确定为一般公认安全（gernerally recognized as safe，GRAS）添加剂[50]。有研究表明乳酸钠（NaL）可作为防腐剂显著抑制铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的生长[51−52]，因此，董庆利等[53]将NaL整合到CPM之中，确定了NaL的最小抑制铜绿假单胞菌浓度。VALÍK等[54]就通过CPM模拟了乳酸，苯甲酸钠和温度对麦芽假丝酵母生长的影响，研究发现乳酸浓度的增加可以延长延滞时间和降低生长速率以及苯甲酸钠对酵母菌群的抑制作用随温度的变化而变化。MARTINEZ-RIOS等[31]则为将Nisin A作为抑菌剂添加到奶酪中的实际应用提供了参考。而MARTINEZ-RIOS等[37]为了探讨葡萄糖酸（gluconic acid, GAC）对单增李斯特菌的抑制作用，在MEJLHOLM 等建立的模型（2009）[28]的基础上增加了与GAC相关的γ函数，结果却显示其在预测奶酪中单增李斯特菌的性能时弱于原始模型。虽然模型的结果看起来增加的GAC函数是无用的，但这也说明奶酪中单增李斯特菌的生长抑制可能是通过食品的pH等其他因素的综合作用导致的，而不是通过GAC发挥作用。因而CPM也可用于排除无效的抑制因素。

除原有的预测微生物模型应用外，核心参数模型也逐渐应用到其他方面。例如，以往有关细菌生物被膜的研究多为定性[55−57]，研究人员开始利用CPM定量评估环境因素对生物被膜形成的影响，展现了模型使用的广泛性。DIMAKOPOULOU-PAPAZOGLOU等[11]建立了评估pH和aw对新港沙门菌（S. newport）的生物被膜形成能力的CPM和概率模型，发现允许沙门菌形成生物被膜的pH和aw的范围比允许细菌生长的范围更大。TANGO等[58]开发了评估pH、乙醇浓度和aw对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的生物被膜形成能力的CPM。尽管上述模型基于简化的生长介质（液体培养基）以及间接测定（光密度）形成的生物被膜，但开发的模型为量化影响生物被膜多种环境因素的整体相互作用奠定了良好的基础，并且可以为控制生物被膜提供有用的信息。对于生物被膜建模方法的发展具有重大价值，包括开发直接定量生物被膜的方法，基于实验室基质的食品基质和食品相关环境（食品接触表面）中模型的预测能力的评估和验证，其他环境因素（例如温度、抑菌剂等）对生物被膜形成影响的描述，以及在生物被膜形成模型中纳入变异性。

CPM也开始用于研究其他单细胞生物的生长情况。例如在成功优化微绿球藻在浊静操作下的稳态生物量生产力的基础上[59]，WEISE等[60]利用动态的粗粒度模型和CTMI来描述不连续操作过程中中试规模的管状光生物反应器内与光和温度有关的特定微藻的生长速率，以最终预测生物量的增长并且根据模型的反馈结果优化了工艺参数，明显提高了生产率，为转移至更大规模的管状光生物反应器提供了参考。上述的研究为CPM乃至预测微生物在食品安全以及生产中的应用提供了新的可能。

4 小结

描述多环境因素的核心参数模型可以应对复杂的食品环境，有其研究和发展的必要性。国外自20世纪90年代起对CPM的研究逐渐增多，其研究对象不仅包括单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌等食源性致病菌，还包括黑曲霉菌等腐败真菌。科研人员通过增加新的环境参数γ函数以及对原有的模型因子进行优化或扩展来有效地提高CPM的准确性，但国内与此相关的研究仍较少。CPM考虑了各种食品特性和存储条件的影响以及这些环境因素的影响，然后通过模型预测并监控食品环境中的微生物，从而确定食品的安全性，使开发或重新制定安全食品配方（例如改变的pH和有机酸浓度）变得更加容易和快捷。与此同时，CPM的使用也日趋多元化。

为了使核心参数模型能够更好地运用于实践中，还有许多工作需要完善，对于CPM未来地研究方向展望如下：a.建立CPM需要大量的试验数据，因而试验负担很大，需要思考简便的试验方法包括已经发表的文献数据来有效地缩短模型的研发时间；b.现在研究的CPM多以培养基为基础，与实际的食品基质存在一定区别，同时微生物的生物学特性各不相同，为了解决这类问题，CPM需要根据食品和微生物的种类进行调整，因此在发展过程中需更加多元化、专业化，使CPM更加紧密有效地应用到食品质量和安全控制中去；c.将CPM与已有的微生物预测软件结合，使非专业人员在食品监控和研发过程中可以快速准确地了解并使用相关模型。