纽莫康定杂质C0的制备研究

曾凡洲 刘志钰 朱兵峰 王钦超 张贵民,* 魏荣省

(1 鲁南新时代生物技术有限公司，临沂 273400；2 鲁南制药集团股份有限公司，临沂 273400；3 哺乳动物细胞高效表达国家工程实验室，临沂 273400)

纽莫康定B0(pneumocandin B0)是由真菌Glarea lozoyensis产生的次级代谢产物，是合成抗真菌药物醋酸卡泊芬净(caspofungin)的中间体[1-2]。Glarea lozoyensis除能产生B0外，还能产生A0、A1、A2、B0丝氨酸同系物、B1、B2、B5、B5丝氨酸同系物、B6、C0、D0、D2和E0等多种类似物，不同氨基酸侧链修饰或氨基酸连接顺序的不同导致了纽莫康定化合物的结构多样性[3-4]。其中，纽莫康定C0是B0的同分异构体，为纽莫康定B0生产过程中的关键工艺杂质。纽莫康定B0和C0结构式见图1。两者结构差别仅在于红色标注羟基位置的不同。

当今，药品申报在杂质控制方面越来越严格。药物中含有的杂质会降低疗效和影响稳定性，有的甚至对人体健康有害或产生其他不良反应[5]。所以在纽莫康定B0研制过程中，有必要对纽莫康定C0制备出高纯度的样品，为结构鉴定、质量研究及杂质传递研究提供物质基础。制备型高效液相色谱法在药物杂质研究应用中越来越广泛[6-7]。本研究以纽莫康定B0中试生产过程中富集的杂质物料为原料，通过高压制备色谱、浓缩、干燥等处理过程，得到了C0干粉，并对其进行了结构分析和确证，开发出了一种操作方便、成品纯度高、便于长期保存的制备工艺。

1 主要仪器与试药

Agilent 1260高效液相色谱仪(Agilent公司)；Csprep150工业制备色谱系统(汉邦科技)；DN50制备色谱系统(北京澳诺科技有限公司)；R-1001N型旋转蒸发仪(郑州长城科工贸有限公司)；SHB-B95型循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；DHJK-2020低温冷却循环泵(郑州科泰实验设备有限公司)；SCIENTZ-12ND冷冻干燥机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；热重分析仪，TG209F3(德国耐驰)；UV-2600紫外-可见分光光度计(日本Shimadzu)；Scientific Nicolet iS 10红外光谱仪(美国Thermo)；INOVA-600核磁共振波谱仪(Varian公司)；Agilent 1200RRLC-6520 Accurate-Mass Q-Tof质谱仪(Agilent公司)。

纽莫康定发酵液(鲁南制药集团股份有限公司)；工业级二氯甲烷(山东金岭化工股份有限公司)；工业甲醇(兖矿国宏化工有限责任公司)；制备级乙腈(潍坊中汇化工有限公司)；改性硅胶(苏州纳微科技股份有限公司)；UniSil ® Hilic 2M硅胶色谱填料(苏州纳微科技有限公司)；纽莫康定C0对照品(大同市矿区风华生物科技有限公司)，含量95.11%，批号16002；HPLC用乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 HPLC法测定纽莫康定C0

线性洗脱程序如表1所示。Welch Ultimate HILIC Amide柱，4.6 mm×250 mm，3.5 μm；波长220 nm，流量1.0 mL/min，进样量10 μL，柱温40℃，流动相A为水，流动相B为乙腈。

表1 线性洗脱程序Tab.1 Linear elution procedure

2.2 纽莫康定C0的富集

2.2.1 粗品的制备

纽莫康定粗品以鲁南制药集团股份有限公司专利方法制得[2]。具体如下：将经真菌Glarea lozoyensis发酵得到的含有纽莫康定B0的中试发酵液3000 L(发酵效价为675 mg/L)在搅拌的状态下，用磷酸调节pH值4.2，加入2%的助滤剂硅藻土，混匀，静置0.5 h，过滤，得到固体菌渣。菌渣用2倍95%乙醇浸提，过滤去除菌丝，得浸提液；调整浸提液的醇浓度至20(V/V)。将其以0.5～1.0 BV/h的速度流经D101柱，依次用纯化水、30%(V/V)乙醇-水溶液冲洗树脂柱，然后用80%(V/V)乙醇-水溶液洗脱树脂柱，收集富含纽莫康定B0的洗脱液。在洗脱液中加入0.5%活性炭，在20℃条件下搅拌30 min，过滤脱色。脱色液经过超滤过滤后，加水稀释至30%(V/V)。以0.5～1.0 BV/h的速度流经KB-SPE-HLB柱，用含乙醇30%(V/V)溶液冲洗树脂柱，再用乙醇80%(V/V)溶液洗脱，收集富含纽莫康定B0的洗脱液。将收集到的纽莫康定B0洗脱液，在30℃条件下真空浓缩，得到纽莫康定B0粗品1.30 kg。经HPLC检测，粗品中C0的表观含量为8.78%。

2.2.2 高压液相色谱富集

在Cs-prep150工业制备色谱系统中，以动态轴向压缩技术装柱3 kg改性硅胶。将纽莫康定B0粗品用甲醇、二氯甲烷混合溶液[V(甲醇):V(二氯甲烷)=1:4]溶解，即为上样液。流动相为V[二氯甲烷(工业)]:V(甲醇):V(水)=42:9:1；上样量为11.4 g粗品；洗脱流量为480 mL/min；检测波长设置为276和210 nm。高压液相色谱富集在线图谱见图2。对其分段进行收集，经HPLC检测，图2方框标注部分(RT 91.23～102.50 min)即为纽莫康定C0出峰位置。

对纽莫康定粗品连续上样，收集纽莫康定C0富集液。将纽莫康定C0杂质富集液进行减压浓缩，40℃水浴，-0.090 MPa以下真空，蒸至无冷凝液流出时，加乙醇，继续浓缩。直至浓缩液变成干粉，小心刮出杂质干粉。经HPLC检测，其纽莫康定C0色谱纯度为78.53 %。

2.3 纽莫康定C0的高压液相色谱制备

参考杨渊等[8]在亲水作用色谱法测定纽莫康定B0及其杂质的研究中的实验结果，本实验在DN50制备色谱系统中，以动态轴向压缩技术装柱UniSil®Hilic 2M硅胶色谱填料300 g。在亲水作用色谱(HILIC)模式进行色谱制备。上样液配制：每1.0 g杂质干粉溶至70 mL甲醇中，0.45 μm尼龙66有机膜过滤。进样量：5 mL。流速：120 mL/min。波长：278 nm。制备洗脱程序见表2。

表2 纽莫康定C0的制备洗脱程序Tab.2 Elution procedure for the preparation of pneumocandin C0

在线图谱见图3。根据出峰分段收集。结合HPLC检测，确定下图所示方框标注部分(tR为41.41～44.26 min)为纽莫康定C0。

连续进样，合并收集液。然后对合并液在40℃水浴，-0.090 MPa以下真空，进行减压浓缩。对浓缩液按照表3程序进行冷冻干燥。得到杂质纽莫康定C0干粉1.7395 g。经检测，纽莫康定C0色谱纯度99.19 %，峰纯度999.4(DAD检测器)，热重3.05 %。HPLC图谱见图4。

表3 纽莫康定C0的冻干程序Tab.3 Feeze-drying procedure for pneumocandin C0

2.4 结构鉴定[9-12]

为进一步确定本研究制备所得冻干粉为纽莫康定C0，对其分别进行了质谱(MS)、紫外吸收光谱(UV)、红外吸收光谱(IS)、核磁共振谱(1H-NMR、13C-NMR)分析。

2.4.1 质谱

测试条件为ESI(+)。分子离子峰及归属见表4。结果表明：质谱测得本品的加合离子峰[M+H]+，其质荷比为m/z1065.6，推定其相对分子质量为1064.6，与纽莫康定C0的相对分子质量一致。

表4 纽莫康定C0冻干粉的加合离子峰及归属Tab.4 Molecular ion peaks and attribution of freeze-dried powder for pneumocandin C0

2.4.2 红外吸收光谱

测试条件：KBr压片。纽莫康定C0冻干粉样品的IR谱见图5，各吸收峰归属见表5。对红外吸收光谱的解析如下：

表5 纽莫康定C0冻干粉的IR谱各吸收峰归属Tab.5 Assignment of IR absorption peaks of freeze-dried powder for pneumocandin C0

(1)3349 cm-1为羟基中O-H的伸缩振动吸收，1082 cm-1为羟基中的C-O伸缩振动吸收，说明化合物中含有羟基结构；

(2)3349 cm-1为羟基中N-H的伸缩振动吸收，1237 cm-1为羟基中的C-N伸缩振动吸收，说明化合物中含有氨基结构；

(3)2955 cm-1为甲基的C-H伸缩振动吸收，说明化合物中含有甲基结构；

(4)1655 cm-1为羰基的C=O伸缩振动吸收，说明化合物中含有羰基结构；

(5)1536 cm-1，1517 cm-1，1439 cm-1为苯环骨架伸缩振动吸收，842 cm-1为苯环=C-H的弯曲振动吸收，说明化合物中含有苯环结构。

解析结果表明：该样品的红外光谱图特征与目标化合物的化学结构基本相符合。

2.4.3 核磁共振谱

测试条件：溶剂CD3OD。内标：δTMS0。分析序号见图6。

(1)1H核磁共振谱(1H-NMR)

本研究对纽莫康定C0冻干粉样品进行了1H谱和1H-1H相关谱(gCOSY)测试。测定数据见表6。根据gCOSY谱，结合gHMQC谱和DEPT谱，可对纽莫康定C0冻干粉的1H谱进行归属：

表6 纽莫康定C0冻干粉在CD3OD中的1H-NMR数据Tab.6 1H-NMR data in CD3OD of freeze-dried powder for pneumocandin C0

①1H谱显示有43组氢，由低场到高场氢的积分比例分别为2:2:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:2:1:1:1:2:2:1:1:1:2:1:1:1:2:2:2:2:2:1:3:1:2:1:3:3:3，与纽莫康定C0冻干粉的结构相符。比较典型的有化学位移位于δ7左右的4个芳香氢信号，其中δ7.136处氢为一组双重峰，质子数为2；gCOSY谱显示，该氢与δ6.755氢相关，归属为15/19位氢；gHMQC谱和DEPT谱显示，该氢与次甲基碳(δ129.690)相关，证实为15/19位氢。

②δ6.755处氢为一组双重峰，质子数为2；gCOSY谱显示，该氢与δ7.136氢相关，归属为16/18位氢；gHMQC谱和DEPT谱显示，该氢与次甲基碳(δ116.219)相关，证实为16/18位氢。

③化学位移位于δ5至δ4左右的有8个连氧氢信号，其中δ5.297处氢为一组双重峰，质子数为1；gCOSY谱显示，该氢与δ4.020氢相关，归属为9位氢；gHMQC谱和DEPT谱显示，该氢与次甲基碳(δ75.747)相关，证实为9位氢。

④δ4.555处氢为一组多重峰，质子数为1；gCOSY谱显示，该氢与δ4.993氢相关，归属为3位氢；gHMQC谱和DEPT谱显示，该氢与次甲基碳(δ68.247)相关，证实为3位氢。

⑤δ4.500处氢为一组多重峰，质子数为1；gCOSY谱显示，该氢与δ2.187，δ3.791氢相关，归属为33位氢；gHMQC谱和DEPT谱显示，该氢与次甲基碳(δ71.359)相关，证实为33位氢。

⑥δ4.431处氢为一组单峰，质子数为1；gCOSY谱显示，该氢与δ2.058，δ3.491氢相关，归属为28位氢；gHMQC谱和DEPT谱显示，该氢与次甲基碳(δ71.024)相关，证实为28位氢。

⑦δ4.370处氢为一组多重峰，质子数为1；gCOSY谱显示，该氢与δ5.082，δ2.853氢相关，归属为22位氢；gHMQC谱和DEPT谱显示，该氢与次甲基碳(δ70.902)相关，证实为22位氢。

⑧δ4.273处氢为一组单峰，质子数为1；gCOSY谱显示，该氢与δ4.273，δ4.305氢相关，归属为12位氢；gHMQC谱和DEPT谱显示，该氢与次甲基碳(δ76.989)相关，证实为12位氢。

⑨δ4.273处氢为一组单峰，质子数为1；gCOSY谱显示，该氢与δ4.273氢相关，归属为13位氢；gHMQC谱和DEPT谱显示，该氢与次甲基碳(δ75.806)相关，证实为13位氢。

⑩δ4.020处氢为一组多重峰，质子数为1；gCOSY谱显示，该氢与δ5.297氢相关，归属为8位氢；gHMQC谱和DEPT谱显示，该氢与次甲基碳(δ70.551)相关，证实为8位氢。

⑪化学位移位于δ1左右的有4个甲基氢信号，其中δ1.163处氢为一组双重峰，质子数为3；gCOSY谱显示，该氢与δ1.334氢相关，归属为49位氢；gHMQC谱和DEPT谱显示，该氢与甲基碳(δ20.214)相关，证实为49位氢。

⑫δ0.873处氢为一组双重峰，质子数为3；gCOSY谱显示，该氢与δ4.555氢相关，归属为4位氢；gHMQC谱和DEPT谱显示，该氢与甲基碳(δ19.749)相关，证实为4位氢。

⑬δ0.860处氢为一组双重峰，质子数为3；gCOSY谱显示，该氢与δ1.070氢相关，归属为48位氢；gHMQC谱和DEPT谱显示，该氢与甲基碳(δ11.610)相关，证实为48位氢。

⑭δ0.849处氢为一组双重峰，质子数为3；gCOSY谱显示，该氢与δ1.483氢相关，归属为50位氢；gHMQC谱和DEPT谱显示，该氢与甲基碳(δ20.748)相关，证实为50位氢。

上述数据与纽莫康定C0的结构相符。

(2)13C核磁共振谱

本研究对纽莫康定C0冻干粉样品的13C-NMR谱、DEPT谱、13C-1H相关谱(gHMQC)、远程13C-1H相关谱(gHMBC)进行了测试。测定数据见表7，13C-NMR谱图解析如下：

表7 纽莫康定C0冻干粉在CD3OD中的13C-NMR数据(ppm)Tab.7 13C-NMR data (ppm)in CD3OD of freeze-dried powder for pneumocandin C0(ppm)

①13C 谱显示5 0 组碳峰。结合DEPT 谱、gHMQC谱及gHMBC谱，可得出碳的类型包括：3×CH3CH，1×CH3CH2，15×CH2，3×CH，1 4×C H X，4×C H=，1×C=，1×X C=和8×XC=O，这与纽莫康定C0冻干粉的结构相符。比较典型的有化学位移位于δ170左右的8个氨基酸羧基碳信号，其中δ177.426处季碳峰，gHMBC谱显示，该碳峰与δ2.853，δ2.548H23远程相关，归属为24位的季碳。

②δ175.671处季碳峰，gHMBC谱显示，该碳峰与δ2.241H36远程相关，归属为35位的季碳。

③δ174.596处季碳峰，gHMBC谱显示，该碳峰与δ4.993H2，δ4.610氢31远程相关，归属为1位的季碳。

④δ174.527处季碳峰，gHMBC谱显示，该碳峰与δ4.993H2，δ4.520氢6远程相关，归属为5位的季碳。

⑤δ173.360处季碳峰，gHMBC谱显示，该碳峰与δ4.610H31远程相关，归属为30位的季碳。

⑥δ172.944处季碳峰，gHMBC谱显示，该碳峰与δ4.583H26远程相关，归属为25位的季碳。

⑦δ172.536处季碳峰，gHMBC谱显示，该碳峰与δ4.305H11远程相关，归属为10位的季碳。

⑧δ169.172处季碳峰，gHMBC谱显示，该碳峰与δ5.082H21，δ4.583H26远程相关，归属为20位的季碳。

⑨化学位移于δ158至δ116处的6个碳峰是酪氨酸对位取代苯上的碳信号，其中δ158.493处季碳峰，gHMBC谱显示，该碳峰与δ7.136H15/19，δ6.755H16/18远程相关，归属为17位的季碳。

⑩δ132.970处季碳峰，gHMBC谱显示，该碳峰与δ6.755H16/18远程相关，归属为14位的季碳。

⑪δ129.690 处碳峰，在gHMQC 谱中与δ7.136H15相关，归属为15位的次甲基碳， gHMBC谱显示，该碳峰与δ7.136H19远程相关，归属为15位的次甲基碳。

⑫δ129.690 处碳峰，在gHMQC 谱中与δ7.136H19相关，归属为19位的次甲基碳，gHMBC谱显示，该碳峰与δ7.136H15远程相关，归属为19位的次甲基碳。

⑬δ112.219 处碳峰，在gHMQC 谱中与δ6.755H16相关，归属为16位的甲基碳，gHMBC谱显示，该碳峰与δ7.136H18远程相关，归属为16位的次甲基碳。

⑭δ112.219处碳峰，在gHMQC谱中与δ6.755氢18相关，归属为18位的甲基碳，gHMBC谱显示，该碳峰与δ7.136H16远程相关，归属为18位的次甲基碳。

⑮此外，化学位移于δ76至δ68左右的8个碳峰均为羟基碳信号，化学位移于δ62至δ51左右的8个碳峰均为与氮相连的碳信号，化学位移于δ30至δ20左右的碳峰是脂肪酸链上末端甲基和亚甲基的碳信号。

上述数据与纽莫康定C0的结构相符。

2.4.4 紫外吸收光谱(UV)

测定条件：试剂见表8。

表8 紫外吸收光谱测定条件Tab.8 Determination conditions of UV absorption spectrum

纽莫康定C0冻干粉样品的紫外吸收光谱测定数据见表9。解析如下。

表9 纽莫康定C0冻干粉的UV谱测定数据Tab.9 UV spectrum measurement data of freeze-dried powder for pneumocandin C0

(1)在水溶液中，λmax=218 nm 的吸收峰为纽莫康定C0冻干粉样品中取代苯环K带跃迁吸收峰。

(2)在0.1mol/L NaOH溶液中，λmax=216 nm 的吸收峰为纽莫康定C0冻干粉样品中取代苯环K带跃迁吸收峰，λmax=289 nm的吸收峰为纽莫康定C0冻干粉样品中取代苯环B带跃迁吸收峰。

(3)在甲醇溶液中，λmax=224 nm的吸收峰为纽莫康定C0冻干粉样品中取代苯环K带跃迁吸收峰，λmax=310 nm的吸收峰为纽莫康定C0冻干粉样品中取代苯环B带跃迁吸收峰。

以上紫外吸收光谱表明：本品中可能含有苯环等官能团。

2.4.5 综合解析

对制备所得冻干粉综合解析如下。

(1)紫外吸收光谱表明，本品含苯基等结构，与纽莫康定C0冻干粉结构相符。

(2)红外光谱显示，本样品中存在甲基、羟基、氨基、羰基、苯环等结构，该样品的红外光谱图特征与纽莫康定C0冻干粉结构相符。

(3)1H谱显示有43组氢，由低场到高场氢的积分比例分别为2:2:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:2:1:1:1:2:2:1:1:1:2:1:1:1:2:2:2:2:2:1:3:1:2:1:3:3:3，与纽莫康定C0冻干粉的结构相符。

(4)本品的13C谱显示50组碳峰，这与纽莫康定C0冻干粉的结构相符。

(5)质谱测得本品的加合离子峰[M+H]+，其质荷比为m/z1065.6，与纽莫康定C0冻干粉的加合离子峰(分子量为1064.5)一致。

综上，将该样品同时进行紫外光谱、红外光谱、核磁共振波谱、质谱分析，结果显示样品与纽莫康定C0结构相符。本研究制备所得的C0冻干粉即为纽莫康定C0。

3 讨论

目前，国内外在纽莫康定分离纯化的研究中，多集中于纽莫康定B0，对其同分异构体C0的制备鲜有报道。王欣荣等[13]给出了一种高效分离纯化纽莫康定的方法，将纽莫康定A0和C0进行了有效分离和去除，但是并没有提供能够提纯纽莫康定C0的具体措施。孟慧云等[14]在丝状真菌SIIA-F1108产生抗真菌物质的分离纯化和结构鉴定的研究中，能够得到纯度在95%以上的组分，并进行了相关结构鉴定，但是并未制备出色谱纯度高于99.00%、且量在克级水平的样品。本研究通过提取工艺富集、高压液相色谱制备、浓缩、干燥，能够制备出色谱纯度99.19%，1.7395g纽莫康定C0。冻干粉经检测，峰纯度为999.4，热重为3.05%，在C0含量上提供了有力保证，并且经过了紫外吸收光谱、红外光谱、核磁共振、质谱等4大谱结构分析，确证了其结构，为质量研究及下游卡泊芬净合成杂质传递研究提供了可靠的物质基础，可以为纽莫康定其他杂质的制备提供思路。另外，本研究制备出的纽莫康定C0色谱纯度高，峰纯度合格，通过热重法检测水分含量少，可以作为该杂质的对照品使用。