p38MAPK介导的TGF-β1与BMP-7在泡型肝包虫病纤维化中的表达*

李栋 朱海宏 陈敏 杨效

(1.成都京东方医院，四川 成都 610200；2.青海省人民医院，青海 西宁 810000)

泡型肝包虫病是一种慢性的寄生虫感染性肝脏疾病，大多数患者分布于西北牧区，主要是因为食用生食而导致多房棘球蚴感染[1-3]，在我国其发病率受地域影响较重。在临床工作中可见部分患者病灶周边肝脏发生纤维化，影响肝脏术后代偿功能，降低预后效果。目前国内外对肝纤维化的研究主要集中在炎性刺激因子[4-6]如肿瘤坏死因子、白细胞介素等，其中转化生长因子β1(Transforming growth factor β1，TGF-β1)的致肝纤维化作用也基本达成共识，其可启动肝星状细胞的活化，促使肝星状细胞转化成为成纤维细胞，进而分泌大量细胞外基质，细胞外基质的病态积累引发肝纤维化形成[7-8]。有相关研究[9-11]显示，在乙肝病毒、酒精性肝炎导致的肝纤维化中，丝裂原活化蛋白激酶所属的p38MAPK信号通路发挥了明显的促肝纤维化功效，其可将真核细胞胞外分子信号转至胞内引起细胞反应，在细胞生长、增殖、分化和凋亡等细胞反应的传导中起重要作用，另外可通过传递TGF-β1的生物学信号而发挥功能。人骨形态发生蛋白7(Bone morphogenetic protein-7，BMP-7)属转化因子超家族成员，其有较强的成骨作用外[12]。有研究[13-15]显示BMP-7在心肌及肾脏纤维化中发挥了重要的抗纤维化作用，其可影响TGF-β1的致纤维化作用。因此本课题组将目标锁定在p38MAPK、TGF-β1、BMP-7的研究上，通过完善基础机制研究进一步反馈临床应用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 纳入2017年9月～2018年11月在青海省人民医院诊疗的40位患有泡型肝包虫病患者。病例均为病检明确诊断患者，排除其他理化因素导致的肝脏纤维化患者及不同类型肝炎患者。收集术后切除下的肝脏标本。标本厚度一般超过0.5 cm，一份行经行染色，另一份液氮中迅速冷冻后转移至-80℃冰箱予以保存。样本采集经过患者知情同意，并经过医院伦理委会员批准。

1.2 仪器 台式常温/低温离心机、移液枪、超净工作台、-80℃低温冰箱(美国Thermo Forma公司)，快速混匀器、液氮罐10 L、高压灭菌锅、研磨碗/研磨杵(常州申光仪器有限公司)，恒温箱(华电公司)，PCR仪、Nanodrop2000浓度检测仪、热循环仪(Roche公司)，超纯净水器、切片机、显微镜、载玻片。

1.3 试剂 液氮(西宁液氮公司)，细胞裂解液Trizo、DEPC水、逆转录试剂盒、无水乙醇、4%甲醛、石蜡、氯仿、异丙醇、二甲苯、PCR引物(生信)，HE及Masson染色剂盒(莱宝生物公司)。

1.4 实验分组 根据采集部位分为病灶组(病灶边缘)、距病灶边缘≤2 cm组(距病灶边缘≤2 cm)和距病灶边缘>2 cm组(距病灶边缘>2 cm)。按照HE及Masson染色结果，对上述三组标本进行纤维化分级，分级标准knodell[16](表1)。将纤维化分级标本进一步分为S0纤维化组、S1纤维化组、S2纤维化组、S3纤维化组。其中S0组既无明显纤维化组设为实验对照组，S1、S2、S3三组分别设为目标组。

表1 knodell分级标准Table1 Knodell grading standard

1.5 HE染色及Masson染色 根据HE染色及Masson染色试剂盒说明书操作步骤，按照顺序逐步完成染色，随后显微镜观察各组标本染色情况。

1.6 qRT-PCR检测mRNA表达水平 将在液氮中冷冻标本研磨成细粉状后，加入细胞裂解液然后放置10 min；在4℃低温环境下经12000转离心10 min，将上清转移到无酶离心管中，在离心管中加入200 μL氯仿，密封完毕后，混合均匀，室温静置5 min，再次12000 r，15 min，4℃离心处理，离心完毕后，目标RNA大部分溶解在水相层中，小心吸取500 uL无色水相层移入1.5 mL无酶离心管，加入相同体积异丙醇，放置20 min，再次离心处理，弃除上清夜，保留沉淀，加入75%乙醇，洗涤杂质。RNA质量及浓度检测：利用分光光度计检验RNA浓度及纯度是否合格。总体积：20 μL(RNA6.0 μL、5×Fastking-RT SuperMix 4.0 μL、ddH2O 10.0 μL)。42℃ 15 min 去除基因组及反转录反应、95℃ 3 min酶灭活。扩增反应及条件：2×SuperReal Color PreMix 10.0 μL、正向引物0.6 μL、反向引物0.6 μL、cDNA模板 1.0 uL、ddH2O 7.8 μL。引物序列(TGF-β1：正向5′-ttggcctgccaaacgacttcgg-3′，反向r5′-cgcggcgggatagcgctcct-3′；P38：正向5′-tccaaaggctactccgaatc-3′、反向5′-tgtttcaggtaaaggtgagc-3′；BMP-7：正向5′-GTGGTCAACCCTCGGCACA-3′、反向5′-GGCGTCTTGGAGCGATTCTG-3′ )miRNA扩增(预变性，95℃ 15 min ；变性，95℃，10 s：退火 62℃ 30 s)。相对表达量用2-ΔΔCt表示。

2 结果

2.1 HE染色及Masson染色结果 根据 HE染色及Masson染色结果，病灶边缘大部分为S2度纤维化，距病灶边缘<2 cm范围内大部分为S1度纤维化，距病灶边缘>2 cm肝组织主要为S0度纤维化既无明显纤维化的正常肝组织，见图1、表2。

图1 HE染色及Masson染色结果(40×)Figure 1 HE staining and Masson staining results

2.2 距病灶边缘不同距离肝组织纤维化分级 根据HE染色及Masson染色结果，将各部位肝组织按照knodell标准进行肝纤维化分级，病灶边缘大部分为S2度纤维化，距病灶边缘<2 cm范围内大部分为S1度纤维化，距病灶边缘>2 cm肝组织主要为S0度纤维化既无明显纤维化的正常肝组织，见表2。

表2 不同部位肝组织纤维化分级(n)Table 2 Fibrosis grading of liver tissue at different distances from the edge of lesion

2.3 在泡型肝包虫病纤维化肝组织中TGF-β1、p38、BMP-7的相对表达情况 与S0纤维化组，S1、S2及S3纤维化组肝组织中TGF-β1的相对表达量表达升高，随着纤维化的不断加重，表达量逐渐显著，在S3纤维化组中表达最高，各组间表达水平比较差异具有统计学意义(P<0.05)。p38在S1、S2及S3纤维化组的异常表达倾向，与TGF-β1在泡肝纤维化中的走势高度相似，均较S0组表达明显，纤维化程度越重表达量越高，在S3纤维化组中表达最高，组间差异具有统计学意义(P<0.05)。在S1、S2和S3纤维化组中BMP-7的相对表达走向与p38及TGF-β1明显不同，表达最高为S2纤维化组，在S3纤维化组中的表达有下降趋势，各组间异常表达情况具有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 TGF-β1、p38、BMP-7的相对表达情况Table 3 Relative expression of TGF-β1，p38 and BMP-7

2.4 TGF-β1与p38及BMP-7相对表达量的相关分析 通过综合分析TGF-β1、P38、BMP-7在各组中相对表达量的潜在关联，发现TGF-β1与p38在的异常表达情况呈正性相关(r=0.566P<0.01)，见图2。通过综合三组实验组中 TGF-β1与BMP-7的相对表达情况，发现TGF-β1与BMP-7的异常表达量呈负性相关(r=-0.349，P<0.01)，见图3。在泡肝纤维化中，p38与BMP-7的相对表达无相关性(r=-0.17，P>0.05)，见图4。

TGF-β1相对表达量图2 TGF-β1与p38相关性分析Figure 2 Correlation analysis between TGF-β1 and p38

TGF-β1相对表达量图3 TGF-β1与BMP-7相关性分析Figure 3 Correlation analysis between TGF-β1 and BMP-7

p38相对表达量图4 p38与BMP-7相关性分析Figure 4 Correlation analysis between p38 and BMP-7

3 讨论

目前，关于肝泡型包虫病的研究表明病灶周围肝组织存在不同程度的纤维化，有研究学者采用HE染色证实，在泡肝所致的纤维化中，距病灶5 cm范围内大部分染色结果为S2度纤维化，超过5 cm范围外的染色结果基本均为S0度纤维化[17]。本课题进一步通过HE染色结合Masson染色证实发现纤维化的显著程度与病灶距离有明显的相关性，在2 cm范围内肝组织纤维化比较明显，大多为S2度纤维化。研究结果与大部分其他学者泡肝纤维化的研究类似。

本课题进一步通过检测BMP-7、p38、TGF-β1在不同纤维化级别中的异常表达趋势，发现其中p38与TGF-β1的表达走向较为类似，在各级纤维化组中均异常表达，在S3纤维化组中表达最为活跃，其次为S2、S1度纤维化组，从表达曲线上可发现，p38与TGF-β1的表达活跃度与纤维化严重程度呈正相关性。另通过进一步处理实验数据发现，p38与TGF-β1的相对表达情况成中度正相关性。通过上述实验及其他学者研究结果可推测，p38与TGF-β1在泡肝纤维化的演变中发挥了重要的促纤维化效力，TGF-β1生物信号的传递与p38MAPK介导通路息息相关[18-19]。但进一步查找相关研究报道显示，泡球蚴分泌的囊液未展现出足够的生物效应可促进激肝星状细胞增加TGF-β1的表达及活化[20]，从而进一步推测，泡肝纤维化可能与其他类型肝纤维化有类似的发展机制，主要还是因长期理化刺激破坏肝细胞所致。BMP-7在泡肝纤维化中较其他两个细胞因子具有明显的特征，其并非一味地随着纤维化的加重而大量表达，反而在S2度级纤维中表达最为突出，在S3及纤维化中有表达水平降低的趋势。另综合分析BMP-7与TGF-β1的异常表达结果发现，二者间有一定程度的负相关，二者之间可能存在互相拮抗效应，BMP-7与TGF-β1之间可能存在某种相互作用的机制，一旦某种外来因素导致TGF-β1的表达占优时，打破二者间的平衡变化，参与泡肝纤维化的演化。本实验通过分子维度探索泡型肝包虫纤维化的演化机制，为后续研究提供了一定潜在方向与思路。BMP-7的生物潜力还需进一步激发探索，为肝纤维化的逆转提供可能。

4 结论

本研究显示，TGF-β1的促肝纤维化信号可通过p38MAPK介导通路可转导TGF-β1生物信号而发挥促纤维化生物效应；BMP-7在泡型肝包虫纤维化肝组织中异常表达与TGF-β1之间可能存在某种动态平衡关系，表达失衡可能加剧泡肝纤维化的演化发展。