几种中药内生菌对梨黑斑病菌的抑制作用研究

崔文宁

（衡水学院 河北 衡水 053000）

梨黑斑病因传播性强等特征使其成为世界各地都重视的病害之一[1]。梨黑斑病具有发病部位广、危害时间长的特点，主要危害梨的叶、芽和果实。尤其是嫩芽及幼嫩叶片易感病，病害扩散影响梨树长势[2]。目前，主要用化学方法对梨黑斑病进行干预，然而化学杀菌剂存在很多隐患，并且长期使用单一的杀菌剂可能会导致病原菌变异，使梨黑斑病菌对药物产生抗性。因此，急需寻找一种更安全的防治梨黑斑病的方法，代替或者辅助化学防治[3]。

1 材料与方法

1.1 试验材料。梨黑斑病菌、20种中药内生细菌均由衡水学院园林实验室提供。

1.2 试验方法

1.2.1 培养基制作。①PDA培养基：先称取200 g土豆，洗净去皮切成小块，然后加水煮烂，用纱布过滤杂质，加热，加12 g琼脂，同时不断搅拌并加入葡萄糖30 g，待温度稍冷却，加入1 000 ml的无菌水，再等量分配到锥形瓶中，高温灭菌20 min后取出，放于无菌环境中备用。②NA培养基：将33 g琼脂粉加入到1 000 ml蒸馏水中，加热后于121℃高压灭菌锅中灭菌15 min。③牛肉膏蛋白胨液体培养基：用适量的热水将牛肉膏溶解后，依次加入蛋白胨、NaCl。充分溶解后分装入锥形瓶，再于121℃高压灭菌锅中灭菌20 min。

1.2.2 梨黑斑病菌的分离。取梨病健交界处的组织于PDA培养基上，后置于恒温箱中培养至获得纯的菌株。

1.2.3 中药内生细菌的分离。先取中药组织进行杀菌处理，再用无菌研钵研磨成均匀浆液，后将研磨液倒于NA培养基上，置于恒温箱中培养。

1.2.4 梨黑斑病菌菌丝生长的室内抑菌效果初筛。在激活的梨黑斑菌边缘打取菌饼，再用接种铲将其倒置接种到PDA平板中心。再用无菌接种环分别在中心病原菌上下2.5cm处画一条线，每株菌设3个重复并设对照。于28℃培养箱培养48h后，测量菌落生长，后每隔24h测量1次，直到对照长满为止，计算抑制率。

1.2.5 梨黑斑病菌菌丝生长的室内抑菌效果复筛。用直径为0.6 cm的打孔器在梨黑斑病菌附近准确取样，再用接种铲将其倒置接种到PDA平板的中央，在距离病原菌周围3 cm的地方放置3个无菌滤纸片，形成个等边三角形，在滤纸上滴入20μL配置好的OD值为0.600菌液，在28℃恒温培养箱中培养48 h后观察并测量菌落生长情况，之后每隔24 h测量1次，直至对照长满，并计算抑菌率。抑菌率计算公式：菌丝生长抑制率(%)＝[(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径]×100。

1.3 数据统计分析。使用Excel2019绘制和分析数据，并使用SPSS22.0软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 梨黑斑病菌拮抗中药内生菌的筛选。梨黑斑病菌菌丝生长的室内抑菌效果初筛得到数据如表1所示。由表1可知，这20种内生菌中，益母草叶6、益母草叶2、益母草叶4、益母草叶1、知母根6和益母草叶8这6种内生菌对梨黑斑病菌有较显著抑制作用，抑制率最高达到92.55%。这6种细菌之间差异不显著，进行下一步实验；而益母草根2、益母草根4、知母根5、知母叶2、知母根3、知母叶1、知母根4这7种细菌抑菌效果不明显，抑菌率低于30%，分别为2.74%、7.84%、7.84%、9.41%、14.15%、17.25%、26.27%，这7种细菌的抑菌效果较差，舍去；其余7种细菌抑菌率在30%～80%，抑菌效果一般，舍去。

表1 中药内生细菌对梨黑斑病菌菌丝生长抑制效果

2.2 中药内生细菌对梨黑斑病菌菌丝生长的拮抗性能比较。根据初筛结果，选用的6种对病菌抑制效果较好的内生菌，以滤纸片法测定对病菌进行了复筛，结果如表2所示。由表2可知，这6种中药内生细菌对梨黑斑病菌都具有抑制作用，其中益母草叶4抑制效果最好，平均抑菌率高达到60.39%，而益母草叶6和益母草叶2抑制效果一般，平均抑菌率分别为42.75%、40.39%。益母草叶4与其他几种内生细菌之间差异显著。益母草叶1、知母根6和益母草叶6三者之间无显著差异，但三者与益母草叶8和益母草叶2差异显著。

表2 初筛得到的内生细菌对梨黑斑病菌菌丝生长抑制效果

3 结论与讨论

内生细菌在防治植物病害和促进植物健康生长方面具有非常巨大的应用潜力[4]。内生细菌进一步构成植物内部自然的防御体系，可起到全面化、多元化的预防和促进作用[5]。本次试验中大部分内生细菌对梨黑斑病菌有着较好的抑菌效果，其中益母草叶4对抗菌群产生的防御最强，抑菌率达60.39%，能够达到比其他处理更加稳定的效果，而益母草叶1、知母根6、益母草叶6对病原菌抑制效果较好，益母草叶2和益母草叶8对病原菌抑制效果不明显，还需进一步试验研究。所以，益母草叶4对梨黑斑病菌能起到抑制作用，这为进一步研究中药内生菌防治梨黑斑病菌奠定了一定基础。