纤维素酶及其活性提升研究进展

王丰园 金海炎 丁凌飞 鲁云风*

（1南阳师范学院生命科学与农业工程学院 河南 南阳 473061；2车用生物燃料技术国家重点实验室 河南 南阳 473000）

为解决日益加重的能源枯竭问题，近年来各个国家为寻找新型清洁可再生能源开展了大量研究。纤维素是葡萄糖以β-1，4-糖苷键聚合而成，是地球上最丰富的可再生生物质，但是目前对纤维素的利用主要体现在直接燃烧，不仅利用率低，而且还造成大气污染，因此对纤维素的有效利用成为人们关注的核心问题。纤维素酶是纤维素有效利用的关键因素，目前纤维素酶主要应用于食品业、畜牧业、医药业、纺织业和生物质能源等产业[1]，但是这些产业都要求纤维素酶产量大且活性高。因此，如何快速提高纤维素酶活性和纤维素酶的产量，降低纤维素工业化生产成本，是纤维素酶快速应用于工业的关键性技术问题。本文从纤维素酶的来源、纤维素酶活性的影响因素以及提高纤维素酶活性的主要方法等几个方面进行阐述，以期为纤维素酶产业发展和纤维素有效利用提供理论依据。

1 木质纤维素

木质纤维素被誉为地球上最丰富的可再生生物质，是植物和藻类等绿色植物利用光合作用固定二氧化碳的产物，也是地球上含量最多、分布最广的碳水化合物之一；自然界的木质纤维素材料主要由纤维素、半纤维素和木质素有机结合组成[2]。

半纤维素和木质素通过一种特殊的结合方式，紧紧的环绕在纤维素的外面，有效地保护了纤维素内部的结构，使得木质纤维素的二次利用非常困难，因此，木质纤维素开发的关键在于如何安全有效的破坏掉纤维素外面的“保护层”。目前主要采用酸处理、碱处理及微生物酶解处理等方法，破坏木质纤维素的基本结构，增大底物和酶的接触面积，从而有效提高木质纤维素的综合利用率[3～4]。

天然的纤维素分子结构是由结晶区纤维素和非结晶区纤维素相互交错排列形成的(图1)。结晶区纤维素比非结晶区部分更难被酶攻击，晶态纤维素含量较高，这意味着纤维素的降解率会较低[5]。纤维素酶主要降解纤维素的非结晶区，当作用于晶体纤维素时会严重受阻，极大地降低纤维素酶与底物的结合率，因此会降低生物质的酶解效率。通过在不同生物质中的研究表明：生物质经过复杂的预处理后，纤维素结晶度是酶解效率的重要负影响因子之一[6]。

图1 纤维素结晶区与非结晶区展示图[7]

2 纤维素酶

纤维素酶是可降解纤维素的一类复杂酶系的总称，目前公认的主要功能酶有内切β-1，4-葡聚糖酶(EGs，EC 3.2.1.4)、外切β-1，4-葡聚糖酶(CBHs，EC 3.2.1.91)和β-1，4-葡萄糖苷酶(BGs，EC 3.2.1.21)3类[8]；关于纤维素降解机理，研究人员普遍接受和认同的理论是协同降解理论(图2)，其基本原理和特点是内切β-1，4-葡聚糖酶首先发挥作用，它可以识别并切断长链纤维素分子内部的β-1，4-糖苷键，产生大量的短链纤维素，为外切β-1，4-葡聚糖酶发挥作用奠定了基础。外切β-1，4-葡聚糖酶可以识别并切断纤维素分子末端的β-1，4-糖苷键，识别位置在末端2号位或4号位，形成许多纤维二糖和纤维四糖，纤维四糖继续被该酶水解为纤维二糖。最后β-葡萄糖苷酶能够将识别并酶解纤维二糖β-1，4-糖苷键，生成葡萄糖[9]，该酶在整个纤维素降解体系中发挥着至关重要的作用，可以消除前2种酶的产物抑制效应，是纤维素降解酶系中的限速酶。

图2 纤维素酶协同降解纤维素[10]

3 纤维素酶来源

自然界为纤维素酶的来源提供了广阔的途径，在细菌、真菌、放线菌中都有大量的分布。

3.1 细菌。目前产纤维素酶的主要细菌类型及相应研究较多的菌属有厌氧发酵菌热解纤维素菌属(Caldicellulosiruptor)、梭菌属(Clostridium)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、纤维杆菌属(Fibrobacter)、醋酸弧菌属(Acetivibrio)、丁酸弧菌属(Butyrivibrio)；好氧发酵菌热杆菌属(Caldibacillus)、热酸菌属(Acidothermus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、小双孢菌属(Microbispora)、高温单胞菌属(Thermomonospora)、嗜纤维菌属(Cytophaga)、生孢嗜纤维菌属(Sporocytophaga)等。有研究表明，细菌降解纤维素的能力较弱，是因为其只能分泌葡聚糖内切酶，大部分都没有降解纤维素晶体的作用，并且细菌产生的纤维素酶不能分泌到胞外，酶的提取和纯化难度大、成本高，所以目前不适合用于工业生产[11]。对细菌的开发应着重于厌氧或兼性厌氧菌方面，主要在于这些菌种在环境保护和饲料发酵等方面作用尤其突出，因为降解污物纤维素和饲料发酵加工等都在缺氧条件下进行，好氧真菌则无法使用[12]。

3.2 真菌。真菌是目前已知的产纤维素酶的能力较强的微生物，主要在于真菌可以分泌胞外纤维素酶，真菌在生长过程中，其菌丝可以穿透植物的角质层，破坏掉部分木质纤维素的结构暴露出纤维素，其分泌的胞外纤维素酶可直接与纤维素结合进行酶解，从而提高降解效率。目前为止产纤维素酶真菌中研究较多的有木霉属(Trichoderma)、青霉属(Penicillium)、曲霉属(Aspergillus)等[13]。迄今发现的产纤维素酶真菌中，大部分为好氧型，但也有部分是厌氧型的；张艳英[14]研究了哺乳动物的瘤胃液中的产纤维素酶真菌，并成功分离出8株厌氧型产纤维素酶真菌。不同营养类型的真菌也为纤维素资源化利用的不同场景提供了可能。

3.3 放线菌。放线菌降解纤维素的能力要比真菌和细菌低的多，是因为其代谢非常慢，产纤维素酶量极低，分泌的纤维素酶种类较少，且对纤维素酶活性较弱，因此很少应用到工业生产。但是放线菌产生的纤维素酶在强碱和高温环境下仍然能较高的维持其原有的纤维素酶活性，目前研究较多的主要是纤维放线菌、玫瑰色放线菌以及黑红旋丝放线菌[15]。

3.4 其它来源。自然界中能够高效降解木质纤维素的系统还有很多，其中白蚁与其共生微生物协同降解木质纤维素一直被世界各国学者所关注；目前认为白蚁降解木质纤维素体系是通过白蚁自身分泌的内源纤维素酶和其共生微生物分泌的外源纤维素酶协同发挥作用，是一种双重降解机制。梁世优[16]等研究了培菌白蚁的共生机制，培菌白蚁独特生存方式是在其巢内形成的一种三维立体多孔状结构—“菌圃”，这种特殊结构为共生菌鸡枞菌(Termitomycesspp)提供了生存空间，二者互利共生，形成了独特的木质纤维素降解体系。培菌白蚁的共生真菌是通过水平传播得到的，但是在大白蚁属及小白蚁属中共生菌的来源是垂直传播得到的，有研究表明成熟的蚁巢中仅存在一种共生真菌。

4 提高纤维素酶活性的策略

纤维素酶本质是蛋白质，其活性受温度、pH值、酶浓度、底物浓度和离子强度等影响，不同种类的纤维素酶有不同的最适反应条件。纤维素酶具有作用条件温和、特异性强、不产生其他杂物、安全、无污染等优点，是纤维素工业化的研究热点。但目前纤维素酶普遍存在酶解效率低、反应时间长等问题，这导致第一次纤维素乙醇工业失败[17]。为解决这一问题，各国学者采取了多种策略以提高纤维素酶活性，包括添加合适的酶助剂、对微生物进行诱变改良、基因工程育种和原生质体融合育种等。

4.1 添加酶助剂。表面活性剂(Surfactant，SF)是具有1个疏水基团和1个亲水基团的一种两亲性分子，能够表现出乳化、增溶等特性，从而通过增加酶、底物以及溶剂的互溶来提高酶解效率。根据其极性基团的解离性质，SF可分为离子型和非离子型。非离子型SF对纤维素酶的酶解效率促进较大，如Tween(吐温)和聚乙二醇，因其具有稳定性高、溶解性好等优点，在提高纤维素水解率上有显著作用[18]。杨耀刚[19]等研究发现金属离子与表面活性剂可不同程度的提高摇瓶中还原糖的含量，即可提高纤维素酶解效率，其中促进效果最好的金属离子是Co2+和Cu2+，促进效果最好的表面活性剂是SDS(十二烷基硫酸钠)。王亚林[20]等研究发现表面活性剂Tween80和“一枝花”洗衣粉均能有效促进木霉菌产生纤维素酶。王超[21]等研究结果表明：Na+、Ca2+、Mn2+、Zn2+对该纤维素酶活性有促进作用。

4.2 微生物诱变育种。在微生物发酵工业中，通过人为的方式对菌种施加某种诱变因素，使微生物遗传物质发生改变，引起细胞物质代谢改变，通过筛选可以得到高产菌株，降低工业化生产成本；目前常用的诱变技术分为物理诱变、化学诱变和复合理化诱变。徐广伟[22]通过复合理化诱变(紫外照射-LiCl)康氏木霉，筛选出1株突变株E-1 CMC(羧甲基纤维素钠)，其酶活增长率是350.5%，而FPA(滤纸酶活)酶活增长率是87.65%。

4.3 基因工程育种。基因工程育种是直接对纤维素酶基因进行改造，可以快速、定向地对纤维素酶基因进行修饰，获得新的高比活力纤维素酶。改造后的纤维素酶在稳定性和催化活性等方面也有很大的提升，对提高酶的生产效率及降低生产成本具有重要意义。因此，通过基因工程构建高效表达高活性纤维素酶的基因工程菌，是国内外研究的热点之一。人们已经将纤维素酶的基因克隆到细菌、酵母、真菌中，并得到了重组型纤维素酶的表达菌株。丁轲[23]等利用PCR及酶切等技术将2个纤维素酶基因连接在一个开放阅读框内，构建重组表达载体，然后转化到大肠杆菌进行表达。随后通过大肠杆菌摇瓶培养，在培养液中成功检测出融合纤维素酶，通过试验该酶可适应较广的温度和pH值范围，酶活性对金属离子敏感。还可以利用基因工程技术，来抑制阻遏基因的表达，从而提高目的产物的产量。邓嘉雯[24]等通过构建多靶向siRNA表达载体对里氏木霉碳阻遏抑制因子进行干扰，成功抑制里氏木霉的分解代谢物阻遏基因的表达，使得纤维素酶基因能够充分表达，通过摇瓶培养检测纤维素酶活力，干扰后的纤维素酶活性明显比原始菌株要高。还有一些学者利用基因敲除技术，来修改表达基因，得到高产菌株，如刘富川[25]等采用基因敲除技术，去除掉纤维素酶转录调控因子bglr基因及其上下游序列，获得bglr基因敲除的菌株EU7-22Δbglr，该菌的纤维素酶活力均有不同程度提高。基因敲除技术是目前国内外研究的热点，其应用广泛，目的性较强。

4.4 原生质体融合育种。原生质体融合(Protoplast Fusion)是一种基因重组技术。用相应水解酶除去细胞壁，制成由细胞膜包被的裸细胞，然后选择适当的物理、化学或生物的方法进行诱导融合，经过融合，遗传物质重组并成功生存下来，通过筛选可获得有效产物的高产菌株，为微生物应用于工业生产提供广阔空间。该技术已成为微生物育种的研究热点。研究者利用原生质体融合技术，可以实现既能产生纤维素酶，又能产生木质素酶的强化菌株；对于纤维素酶生产菌株的改良，原生质体融合技术比常规杂交育种具有更大的优越性。张素敏[26]等通过制备产纤维素酶菌株里氏木霉T306原生质体，分别将其进行紫外照射和微波辐射双亲灭活后，通过化学试剂聚乙二醇诱导原生质体融合，原生质体融合率为0.5%。经过2轮原生质体融合试验，通过筛选获得1株遗传稳定，纤维素酶活力较出发菌株有明显提高的融合子。曾柏全[27]等将高产纤维素酶的青霉菌与强抗逆性的枯草芽孢杆菌分别经过高温、紫外双亲灭活后，通过化学试剂聚乙二醇诱导原生质体融合，最终成功筛选出了1株抗逆性比原始菌株有明显提高的高产纤维素酶优良菌株。

5 展望

目前选育的产纤维素酶系菌株，都存在产酶量不高、酶活性较低等问题，造成生产成本高，不能应用于工业生产中。自然界的菌株均难满足工业化生产要求，必须对其进行适当改良，以适应工业生产。在对菌株改良的方法中，复合理化诱变效果最为理想，广泛应用于各种菌株改良，具有效率高、操作简单等特点，但是诱变育种存在不定向性和盲目性，要进行多次重复试验才有可能获得理想菌株。这是因为人们需要的产物往往是多基因控制的，例如目的产物代谢途径上的结构基因、调节基因、辅助基因等，这些基因不可能通过一次诱变全部引起突变，而获得高产菌株，即使有这种可能，菌体DNA由于一次性改变太大，细胞代谢严重失调，而失去生存的可能性。但是复合理化因素交替处理时，诱变剂量应适中或偏低。

原生质体融合技术是获得多功能产酶强化菌株的关键，首先要从自然界获得性状优良的菌株，经过诱变改良后，可以作为原生质体融合的亲本，经过融合可获得多功能强化菌株。原生质体融合比常规遗传育种具有明显优势，它使亲本的全部遗传物质进行重组，双亲优良性状的保留率更高，但是原生质体融合存在较大重组随机性。相比以上方法，基因工程育种具有可操作性及目的性强等优点，目前在实验室阶段已成功克隆纤维素酶基因，并转化细胞进行表达，但其目的产物分泌量不尽人意，还需进一步研究。另外还应结合基因修饰技术来改良产纤维素酶基因，以构建出快速高效表达纤维素酶的基因组成。除了研究菌株内部因素外，添加酶助剂等外部因素也很重要，因此，也应加大寻找理想的酶助剂的研究力度，使纤维素酶的活性能更好的发挥出来。

选育和改良酶活性高、耐受性好、酶系多样均衡的高产纤维素酶菌株仍然是纤维素酶产业化研究的重点。随着现代生物技术的发展，对高产纤维素酶工程菌研究的逐渐深入和完善，将大大地推动纤维素酶产业化的发展。