EPAS-1在透明细胞性肾细胞癌中的表达及意义*

陈海滨 王立姣 赵鹏 赵建军 谭超

(河北工程大学附属医院 1.泌尿外二科;2.呼吸内二科;3.胸外科,河北 邯郸 056004)

透明细胞性肾细胞癌临床常见[1-2]，尽管治疗手段取得了重要的进步，但其5年生存率仍然较低[3-4]。基因的异常表达是肾肿瘤发生和进展的重要分子遗传因素[5-6]。近年学者发现内皮PAS结构域包含蛋白-1(EPAS-1)与肿瘤的形成有关。EPAS-1又称低氧诱导因子2α(HIF-2α)，是1997年克隆出的含有HLH-PAS的蛋白，是缺氧的主要转录因子，在低氧时引起酶或基因变化发挥促进肿瘤进展的作用[7]。EPAS-1主要在低氧区域诱导癌基因表达、调节细胞异型增生促进血管新生，主要是为适应细胞微环境中的低氧状态[8]。目前EPAS-1在透明细胞性肾细胞癌中的研究鲜少，其与细胞增殖的关系尚需要阐明。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2017年1月～2017年7月在我院确诊为透明细胞性肾细胞癌并行手术治疗的患者78例。其中男40例，女38例，年龄43～85岁，中位年龄60岁。肿瘤最大径(0.6～9.5)cm，平均(4.3±1.1)cm；分级(Fuhrman)：Ⅰ级9例，Ⅱ级34例，Ⅲ级29例，IV级6例；其中30例伴有肾窦累犯，48例无肾窦累犯。均留取术后新鲜的肿瘤组织作为观察组，留取距肿瘤标本肉眼可见的边缘>3 cm的正常肾组织作为对照组，样本均于-80℃冰箱中冻存。纳入标准：①首次发病并手术治疗，术后病理为透明细胞性肾细胞癌，并符合WHO中的标准及分型。②临床及随访资料完整。排除标准：①诊断不明确或病理形态中伴有异源性上皮或间叶分化的肿瘤。②术前行放、化疗。③伴有其它器官严重的内科系统疾病。患者或家属签定知情同意书，研究符合《赫尔辛基宣言》中的相关要求，并经医院伦理委员会批准。

1.2 实验材料 选择人肾透明细胞癌786-0细胞系和人肾皮质近曲小管上皮HK-2细胞系，购自中国科学院上海细胞库。培养基PRMI1640及胎牛血清购自Gibco公司；ECL显色液购自Thermo公司；EPAS-1、GAPDH、PCNA、二抗和DAB购自苏州睿赢生物技术公司；CCK-8试剂盒购自上海碧云天生物公司；RIPA裂解液、胰酶消化液、质粒提取试剂盒、二抗及DAB购自武汉三鹰生物公司；载体和引物均由苏州吉玛基因生物公司合成，酶标仪为Thermo公司生产的MK3，PCR仪为美国Bio Rad IQ5。

1.3 方法

1.3.1 细胞的构建和培养 液氮中取出人肾透明细胞癌786-0细胞系和人肾皮质近曲小管上皮HK-2细胞系，冰上复苏，应用10%胎牛血清RPMI 1640培养基，在37℃、5%的CO2浓度的孵育箱中进行培养。当细胞生长融合度至80%左右时，进行细胞传代，调整细胞浓度为5×105个/mL接种于12孔板中，每孔1 mL。选择人肾透明细胞癌786-0细胞系，设计小干扰RNA EPAS-1质粒并构建质脂体载体转染建立小干扰RNA EPAS-1组(siRNA EPAS-1组)，并设立786-0细胞系的空白对照组(NC组)。

1.3.2 实时荧光定量PCR实验 应用实时荧光定量PCR(RT-PCR)法检测EPAS-1 mRNA的表达。Trizol提取总RNA后应用 Nanodrop2000微量紫外分光光度计测量提取的总RNA浓度和纯度。引物序列：上游：TACGTGTGCCCGGTTACGTCGACCG，下游：TCGGGTTAAAGGCCAGATAGTAGAG。以RNU6B为内参基因，引物序列：上游：TCGTGATA GTGATGATCCAGCCA，下游：CGTAGTAGTAC AGATAGTAGATGA。逆转录合成cDNA，反应条件：16℃ 30 min；42℃ 30 min，85℃ 5 min后，4℃恒温。实时荧光定量PCR反应条件：95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 1min，30个循环后进行延伸。读取Ct值，以2-ΔΔCt法表示结果，以RQ进行定量分析。

1.3.3 免疫组化实验 应用免疫组化SP法检测组织中EPAS-1和PCNA蛋白的表达。切取4 μm切片，严格按实验步骤加入一抗和二抗后行DAB显色。操作由同一主管技师完成，做好质控工作，减少人为误差。EPAS-1的显色部位是细胞质和(或)细胞膜，以黄色-棕褐色为阳性。以二维评分法进行定量(着色强度和阳性率)。着色强度：无着色为0分，弱为1分，中为2分，强为3分。阳性率：选择5个高倍(400倍)视野进行观察，取平均值，阳性率<5%为0分，5%～10%为1分，以11%～25%为2分，以26%～50%为3分，以>50%为4分[9-10]。二者相乘为最终评分，总分范围0～12分。以≤3分为阴性，以>3分为阳性。计算阳性率。PCNA的表达部位是细胞核，以黄色--棕褐色为阳性，选择热点区进行观察，共选择5个高倍(400倍)视野计算阳性率，取平均值，其阳性率即为增殖指数。

1.3.4 Western Blot实验 应用Western Blot法检测EPAS-1和PCNA的表达。以GAPDH为对照，基于新鲜组织，提取总蛋白，BAC法行蛋白浓度测定，SDS-PAGE凝胶配置后上样、电泳、转膜、封闭，严格按照说明书进行操作。利用Odessey红外荧光成像仪扫描PVDF膜，以GAPDH为对照，分析灰度值，进行结果分析。

1.4 术后随访 患者均进行术后3年生存时间的随访，截止时间点为2020年7月31日。

2 结果

2.1 两组中EPAS-1表达阳性率的比较 观察组中EPAS-1的阳性率高于对照组(P<0.05)，见表1、图1。

表1 两组中EPAS-1表达阳性率的比较[n(×10-2)]

图1 EPAS-1的表达(IHC SP法)

2.2 EPAS-1在观察组不同临床病理特征中表达阳性率的比较 EPAS-1的阳性率在不同Fuhrman分级、肿瘤最大径及PCNA增殖指数的表达中差异有统计学意义(P<0.05);而在有无肾窦累犯、不同性别及年龄分组的表达中差异无统计学意义(P>0.05)。见表2、图2。

表2 EPAS-1在观察组不同临床病理特征中表达阳性率的比较[n(×10-2)]

图2 肿瘤中PCNA的表达(400×)

2.3 观察组中EPAS-1的表达与生存时间的相关性 随访截止发现存活49例，死亡28例(其中1例因脑出血死亡，1例为意外死亡，均计为删失值)，失访1例。应用K-M生存分析显示EPAS-1的表达与生存时间有关(2=4.0213，P=0.0210)。见图3。

图3 EPAS-1表达的生存分析

2.4 人肾透明细胞癌786-0细胞系和人肾皮质近曲小管上皮HK-2细胞系中EPAS-1蛋白和mRNA的表达比较 Western Blot结果显示人肾透明细胞癌786-0细胞系中EPAS-1蛋白的表达明显高于人肾皮质近曲小管上皮HK-2细胞系(P<0.05)；RT-PCR结果显示人肾透明细胞癌786-0细胞系中EPAS-1 mRNA的表达明显高于人肾皮质近曲小管上皮HK-2细胞系(P<0.05)。见表3、图4、图5。

表3 两组细胞系中EPAS-1蛋白和mRNA表达的比较

图4 EPAS-1蛋白的表达

2.5 人肾透明细胞癌786-0细胞系的siRNA EPAS-1组和NC组中PCNA蛋白和mRNA的表达比较 Western Blot结果显示，siRNA EPAS-1组中PCNA蛋白的表达明显低于NC组(P<0.05);RT-PCR结果显示siRNA EPAS-1组中PCNA mRNA的表达明显低于NC组(P<0.05)。见表4、图6、图7。

表4 siRNA EPAS-1组和NC组中PCNA蛋白和mRNA的表达比较

图6 siRNA EPAS-1组和NC组中PCNA蛋白的表达

图7 PCNA mRNA的表达

3 讨论

透明细胞性肾细胞癌病变形成与基因和遗传因素有关[11]。EPAS-1是从小鼠下丘脑细胞和HeLa细胞中克隆出的全长cDNA序列[12]，其开放阅读框2607bp，编码869个氨基酸，分子量为96.5kDa[13-14]。EPAS-1的基因定位于染色体的2p16-21，共有15个外显子、14个内含子[15]，5′-端与AHR基因的内含子具有高度保守性，3′-端只有1个内含子[16]。EPAS-1与家族的同一成员HIF-1α具有相似的生化和转录活性。研究显示在缺氧条件下，两种蛋白质均能快速增多，而氧恢复后均快速下降[17]。同时抗氧化剂(NMPG)、蛋白酶体抑制剂等的处理也能引起细胞内两种蛋白的增加，而H2O2能引起两者表达的下降[18-19]。EPAS-1与HIF-1α的不同点表现为两种蛋白质含量不一样，一般来说，肿瘤细胞内EPAS-1含量较高，而HIF-1α主要表达在间质细胞和组织细胞内。EPAS-1和HIF-1α调控下游因子可能不同，EPAS-1主要是调控PCNA介导的细胞增殖，表现为肿瘤细胞增殖的特性，而HIF-1α主要是调控VEGF介导的血管生成，表现为间质的支持作用。EPAS-1对肿瘤相关巨噬细胞介导的作用不如HIF-1α的作用强[20]。

本研究结果显示,透明细胞性肾细胞癌中EPAS-1的表达明显高于正常肾组织，人肾透明细胞癌786-0细胞系中EPAS-1蛋白和mRNA的表达明显高于人肾皮质近曲小管上皮HK-2细胞系，提示EPAS-1高表达是肿瘤形成的重要促进因素，即EPAS-1具有癌基因样的作用。且EPAS-1表达的阳性率在不同肿瘤最大径及PCNA增殖指数的表达中差异有统计学意义，siRNA EPAS-1组中PCNA蛋白和mRNA的表达明显低于人肾透明细胞癌786-0细胞系，提示EPAS-1高表达是肿瘤细胞增殖的重要促进因子，抑制EPAS-1的表达能减弱肿瘤细胞的增殖，提示EPAS-1参与肿瘤细胞的分裂增生及肿瘤生长。结果显示EPAS-1的表达与肿瘤的Fuhrman分级相关，由于Fuhrman分级与肿瘤进展及预后相关，因此EPAS-1表达升高是肿瘤进展及不良预后的重要指标，实验观察到EPAS-1的表达与生存时间有关，也进一步明确了EPAS-1与预后的关系。但是EPAS-1对预后的具体判断价值尚需要进行多中心、多因素及大样本分析后进一步明确。EPAS-1的异常表达对mRNA转录、翻译均有重要的调节作用，并能调控核质的运输，引起细胞增殖及肿瘤细胞的转化[21]。EPAS-1在发挥功能时也常受很多因素的影响，如应激反应、细胞微环境的改变等。也有研究认为EPAS-1是诱导癌基因形成的因子之一，对细胞的浸润性生长有重要促进作用[22]。EPAS-1能与AHR相互作用，与缺氧反应元件(5′-TACGTGCG-3′)结合，上调缺氧因子的表达。蛋白酶体的抑制剂能引起细胞内EPAS-1的活性改变，可以消除细胞内活性氧改变，使EPAS-1的表达升高[23-24]。EPAS-1也具有肿瘤血管生成的促进作用，肿瘤进展过程中的缺氧环境能使EPAS-1的转录活性增强，促进肿瘤的侵袭和转移[25]。EPAS-1可提高其下游糖酵解酶基因的表达，影响肿瘤的失控性增殖和能量代谢[26]。

4 结论

EPAS-1在肾透明细胞癌中表达升高，在不同临床病理特征中的表达有差别。EPAS-1可能对肿瘤细胞增殖有一定促进作用。检测EPAS-1的表达可能与肿瘤的预后有关。